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(月季)花(宋-朱淑贞)一枝才谢一枝妍，自是春之不与闻。纵使牡丹称艳艳，到头荣悴片时间。花中皇后月季又称“月月红”，自然花期5至11月，开花连续不断，通常扦插就可以成活。采用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，形成细胞团，进而形成愈伤组织，随后愈伤组织分化成完整的植株的技术。什么是花药培养呢？花药（一）被子植物的花粉发育一、基础知识花药花丝花丝花药：囊状结构，内有很多花粉（一）被子植物的花粉发育1.雄蕊一、基础知识雄蕊一、基础知识2.花粉的概念:由花粉母细胞经过减数分裂形成的单倍体的生殖细胞.小孢子母细胞（花粉母细胞）减数分裂4个小孢子（小孢子四分体时期）1个小孢子（单核居中期）核位于细胞中央（四分体的4个单倍体细胞彼此分离，各自形成具有1个单细胞核的花粉粒）3.花粉发育过程有丝分裂1个小孢子（单核靠边期）花粉管细胞核生殖细胞核营养细胞生殖细胞有丝分裂2个精子（基因型相同）双核期细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧经历时期：四分体时期、单核期、双核期3.花粉发育过程花粉粒类型一个成熟的花粉粒即为雄配子体，有两种情况：二核花粉粒:成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）三核花粉粒:有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。①②移栽花药中的花粉胚状体脱分化愈伤组织花药中的花粉脱分化分化丛芽再分化丛芽诱导生根原因：培养基中的激素种类及浓度配比一、基础知识（二）产生花粉植株的两种途径资料胚状体又称体细胞胚，这种体细胞在形态上能够转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，而且他的发育过程也与合子胚类似，胚芽、胚根、胚轴等结构完整，就像一颗种子。为什么胚状体和愈伤组织到丛芽分别称为分化和再分化？思考胚状体就像种子，有胚芽、胚轴、胚根等结构。胚状体到丛芽就是由原始的分化状态继续生长和分化完成的。愈伤组织形成丛芽的过程是从脱分化状态进入再分化形成丛芽的过程。一、基础知识（三）影响花药培养的因素1、材料的选择从花粉看：从花药看：从花蕾看：月季的初花期单核期完全未开放的花蕾盛开的或略微开放的花都不易选做实验材料为什么不选择使用单核期之前或之后的花药接种？单核期之前的花药，质地幼嫩，极易破碎。单核期之后的花药，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难。为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？•为了挑选到单核期的花药，选择什么样的材料？该材料还有什么优点？花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。菌少、易消毒。完全未开放花蕾一、基础知识（三）影响花药培养的因素2、培养基的组成3、其他因素亲本植株生长条件、材料的低温预处理、接种密度等（一）材料的选取（二）材料的消毒（三）接种和培养二、实验操作②某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法。①最常用的方法有醋酸洋红法2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。1、从花药看：月季的初花期从花粉看：单核期从花蕾看：完全未开放的花蕾（一）材料的选取②焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色)①醋酸洋红法(将染色体染成红色)2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。（一）材料的选取花药（载玻片上）→1%的醋酸洋红1滴→用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）花药（在卡诺氏固定液中处理20min）→取出，置于载玻片上→焙花青－铬矾溶液染色→盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）（二）材料的消毒5、无菌水冲洗3～5次花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒2、无菌水清洗3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4分钟（质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）剥取花药接种花药培养分化培养基培养鉴定和筛选不要损伤花药要彻底除去花丝常常会出现染色体倍性的变化每个培养瓶接种（7～10）个花药花药长出愈伤组织温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。主要原因是营养核和生殖核融合造成的（三）接种和培养灭菌后花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织）彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化。（主要原因是营养核和生殖核融合造成的。）故需对培养出来的植株作进一步的鉴定和筛选。1、选材是否恰当2、无菌技术是否过关3、接种是否成功选材是否成功是花药培养成功的关键。如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。植物组织培养技术与花药培养技术的比较项目相同点不同点植物组织培养技术离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。外植体为体细胞，染色体数无需加倍。花药培养技术取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种。植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。课题成果评价选材是否恰当选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。课题成果评价无菌技术是否过关如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。课题成果评价接种是否成功如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。