pierce生物技术在蛋白质组学中的应用

Pierce生物技术在蛋白质组学中的应用PIERCETechnicalFocus:有机合成，化学偶联，表面化学和分析化学ProductFocus：分子生物学：各种化学发光Blotting,EMSA,RPA,蛋白质组学：蛋白抽提,蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色试剂和预染Markers免疫学：抗体制备,纯化，片断化,分型和修饰交联化学：cross-linker，生物素化试剂……等分子标记试剂Pierce生物技术在分子生物学和蛋白质组学中的应用内容包括以下三个方面：1.WesternBlotting的问题与对策2.蛋白质提取,染色和定量3.蛋白质样品制备之高效透析，一步脱盐，超级浓缩及RED1.WesternBlotting的问题与对策WesternBlotting方法选择检测系统比较检测方法影响Westernblotting成功的要素常见问题分析与对策WesternBlotting方法一直接法：优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便WesternBlotting方法二间接法：优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择4.可选择不同的Marker缺点：1.有交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化两种检测酶系统的比较HRP（辣根过氧化酶)AP（碱性磷酸酶）大小40Kd140Kd最佳酶活性PH：5－7PH：8－10酶活和二抗特异性好于AP抑制剂氰化物，硫化物叠氮钠氰化物，砷酸盐，有机磷，二价阳离子螯合剂稳定性零度以下稳定零度以下不稳定底物很多部分动力学特性快速慢价格便宜昂贵检测方法及特点化学发光法:灵敏、快速、高效、无害、特异性高化学显色法:方便、有毒、灵敏度较低、不易保存同位素法:灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短荧光底物法影响Westernblotting成功的要素蛋白抽提/样品制备/电泳膜的选择和转膜封闭液的选择和封闭条件的优化一抗和二抗的选择以及稀释倍数的优化“通用”二抗合适的底物：发光或显色底物曝光时间的掌控X-光片,信号增强剂Striping抗体剥离bufferEraserit底片背景去除剂封闭液的选择和封闭条件的优化封闭液的选择1、无生物素，无血清蛋白2、无交叉反应3、1－15分钟封闭时间4、10－20：1的信噪比封闭条件的优化1、时间2、温度3、去污剂底物的选择：灵敏度，经济，方便与否发光底物：HRP和AP底物系统:显色底物：HRP和AP底物系统:底片和曝光－成败的最后关头底物与膜孵育X-光片曝光时间的掌握显影和定影液信号增强剂抗体剥离缓冲液底片背景去除剂常见问题比较均一的高背景斑点、发泡式或闪烁式的高背景信号弱或者无信号非特异性条带弥散型条带白色条带、黑点或信号下降太快（一）Poppers蛋白质提取—细胞,组织裂解和蛋白提取的一场革命传统的细胞裂解方法：①机械法，容易引起蛋白质变性和聚集②匀浆破碎法，需要低温进行③研磨法蛋白回收率低④超声破碎法，需要额外设备⑤反复冻融法。Poppers：基于Pierce专有技术用于细胞裂解和核酸、蛋白抽提的高效方法，主要有以下几种：B-PER®,T-PER®,M-PER®,Y-PER,I-PER，P-PER1.M-PER®培养细胞总蛋白提取试剂无须刮擦收集细胞，温和裂解细胞和溶解蛋白适合high-throughput细胞裂解（24，96well)适用范围广非变性剂裂解，与下游分析相容性好蛋白收率高（25-20%via冻融法和超声法）可透析2.T-PER®动物组织总蛋白提取试剂温和可透析:25mMN-二(羟乙基)甘氨酸,150mMNaCI相容性好：可加入蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂和盐可用于各种下游分析操作简单样品:T-PER®1:20(W/V)加入裂解液，匀浆10000rpm离心取上清3.B-PER®细菌总蛋白提取试剂非离子型去污剂，温和裂解高效快速-10min无须昂贵设备：离心分离相容性好：能用于GST，His等亲和纯化可加入蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂和盐可透析，便于下游分析多种选择：不同规模；Trisbuffer;PhosphatebufferB-PER®ReagentforlargerscaleB-PER®ReagentwithPhosphateBufferB-PER®IIReagent4.Y-PER®酵母总蛋白提取试剂2倍于玻璃珠法的蛋白质得率快速(only20mins)室温储存和裂解也可以用于细菌蛋白质的抽提与下游蛋白纯化和功能分析相容可用于Saccharomycescerevisiae,Schizosaccharomycespombe,PichiapastorisandBacillussubtilus等菌株5.I-PER®昆虫细胞总蛋白提取试剂非离子去污剂温和抽提可溶性蛋白质抽提效率高于超声破碎法相容性好，便于下游工作6.P-PER®植物组织总蛋白提取试剂适用多种植物器官组织无需液氮，反复冻融，玻璃珠或匀浆等破碎方法10分钟即可收获活性蛋白，可用于定量，电泳等下游处理（二）蛋白质定量与染色BCAKitCommassie改良增强型KitCompat-Able™ProteinAssay蛋白质超级染色试剂1.BCA基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，吸收值与蛋白浓度在20－2000ug/ml呈线性相关。与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA蛋白定量分析特点:准确灵敏：20－2000μg/ml；MicroBCA0.5-20μg/ml变异系数远小于考玛斯亮蓝法快速：45分钟,比经典的Lowry法快4倍经济实用：试管或微孔板测定与离子型和非离子型去污剂相容与还原剂和金属离子等不相容：BCA蛋白质检测流程：标准品倍比稀释→加工作液孵育→562nm读数→制作标准曲线→回归方程→计算得到样品蛋白浓度（三）Pierce染色试剂Imperial™蛋白质超级染色试剂特点：即开即用，无须配制快速简单:1hrstain,1hrwash无须甲醇/乙酸脱色低背景高灵敏度：－3ng，比同类产品的灵敏度高4–8倍!与质谱分析或测序相容Pierce染色试剂比较StainPartsStepsTimeSensitivityGelCode蓝色染色试剂1260min10-20ngImperiall染色试剂1260min3-10ngKrypton荧光染色试剂13120min0.25ngSilverSNAP染色试剂4335min0.25ngColorSilver染色试剂4465min0.1ngE-Zinc染色试剂3215min0.25ng6xHis染色试剂2690min200ng磷酸化蛋白染色试剂710180min200ng糖蛋白质染色试剂36120min200ng蛋白质样品制备的技术与方法缓冲液更换透析法脱盐法去除特定物质沉淀法亲和法1、高效透析产品2、蛋白质样品浓缩产品3、脱盐产品4、蛋白质净化与富集Kit5、白蛋白/抗体清除Kit6、2-D样品制备7、蛋白质预染Markers1.高效透析产品95%的蛋白质或核酸回收率SnakeSkin®透析袋Slide-A-Lyzer®微量透析管Slide-A-Lyzer®透析卡Microdialyzer微量透析系统RED传统透析的瓶颈：特殊预处理，让你饱受煎熬低回收率，让你暴跳如雷难于操作，特别是处理小量样品难上加难由于泄漏导致珍贵样品的丢失比比皆是长时间透析让你欲罢不能影响透析的因素和如何选择MWCO分子量三维结构水合程度和电荷Buffer(pH值和离子强度)快速透析:选择与蛋白质分子量相近的MWCO高回收率:选择远低于蛋白质分子量的MWCO最好的分离效率:分子量相差10倍2.蛋白质样品浓缩Slide-A-Lyzer®蛋白浓缩液iCON™蛋白质浓缩管Slide-A-Lyzer®蛋白质浓缩液原理：亲水的高分子聚合物，将样品中的水和小分子抽吸出来，达到浓缩目的特点：精制的高分子聚合物，去除了小分子物质，避免了污染80分钟内浓缩5－10倍与透析卡配合使用，效果更佳蛋白质浓缩管瓶颈堵塞离心柱低回收率浓缩效果差长时间离心往往需倒置离心iCON™蛋白质浓缩管30分钟内取得150-400倍的浓缩效果样品收集简单，且无需倒置离心大于90%的样品回收率9K和20K两种截留选择样品范围从1-7毫升和5-20毫升适用于平转头和角转头3.脱盐产品用于快速脱盐用于蛋白质缓冲液置换去除核酸溶液中的酚去除未连接成功的交联剂标记蛋白时未标记的染料分子等去除探针标记时的同位素Zeba蛋白质脱盐离心柱Zeba预装离心式脱盐柱克服了传统脱盐柱的所有瓶颈如：烦琐的重力分部收集受限的上样样品体积样品回收率低回收样品稀释操作费时费力，无法同时多样品并行处理Zeba™离心式脱盐柱截留范围1000;样品700095%的盐和分子量小于1000的分子储留能力易于使用，无需平衡和装柱，离心一步收集无需多步多组分收集，样品几乎没有稀释快速，少于6分钟同时多样品并行处理多种样品体积备选4.PAGEprep®蛋白质净化与富集Kit原理在DMSO存在下，蛋白质与修饰过的硅藻土胶结合，原缓冲液被离心洗去，上样缓冲液离心洗脱蛋白特点：无需透析即可高效去除染料、还原剂，去污剂、糖、甘油、尿素、硫酸铵和胍等与PAGE电泳不相容的杂质处理小至1ul样品10分钟内完成,可直接上样电泳样品浓缩10倍，20μl的胶可以与20μg以上的蛋白质结合，比常规透析法、超滤法高效，简单、快速适用的蛋白质样品：溶解在盐酸胍中的包涵体蛋白硫酸铵沉淀的蛋白质稀释的蛋白质溶液含酸性缓冲液、硫氰酸盐或尿素等柱层析成分的蛋白质PAGEprep®Kit透析超滤样品体积200μl200μl200μl蛋白质回收率70-85%70-90%70-90%所需时间10m20m-10h30-120m是否浓缩是否是5.2-D样品制备试剂盒:膜蛋白的2-D样品制备核蛋白的2-D样品制备可溶性与不溶解蛋白的2-D样品制备胶内胰酶消化Kit磷酸化蛋白肽段分离KitPrepTideTM肽段分选KitPepCleanC-18质谱样品制备Kit