第二章 细胞分离与破碎--2(0).

生科院生物工程系2020/1/17BioseparationEngineering侯志敏第二章细胞分离与破碎主要内容1.发酵液预处理2.细胞分离3.细胞破碎第一节发酵液预处理2020/1/175一、发酵液的一般特性二、发酵液预处理的目的和要求三、发酵液预处理的方法2020/1/176一、发酵液的一般特性•水分含量高（90-99%）•产物浓度低（10%）•发酵液黏度大，不易过滤•残留培养基成分•含有发酵代谢副产物•发酵液含有色素、毒性物质和热源物质等有机杂质2020/1/177二、发酵液预处理的目的和要求（一）目的•改变发酵液特性，加速固液分离•富集分离产物于固相（或液相）•去除部分杂质，减少后续分离负荷2020/1/178（二）要求•菌体分离•发酵悬浮物的去除•固液悬浮物的去除•蛋白质的去除•重金属离子的去除•色素、毒物和热源物等有机质的去除•改变发酵液特性，利于后续分离工作•调节适宜的pH值和温度杨白劳是怎么死的?2020/1/1710卤水点豆腐——凝聚原理•黄豆里的蛋白质团粒被水簇拥着不停地运动，聚不到一块儿，形成了“胶体”溶液。点卤用盐卤或石膏，盐卤主要含氯化镁，石膏是硫酸钙，它们能使分散的蛋白质团粒很快地聚集到一块儿，成了白花花的豆腐脑。2020/1/1711三、发酵液预处理的方法（一）凝集和絮凝方法1、凝集•在凝聚剂的作用下，使发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互凝聚为1mm大小块状絮凝体的过程。•本质：对初始粒子表面电荷的中和、消除离子表面稳定的双电荷层。2020/1/1712胶体双电子层的结构————————————++++++电荷密度+++++++++———————————————+++++++++吸附层扩散层距固体表面的距离正电荷分布负电荷分布2020/1/1713破坏双电荷层的方法•加入具有相反电性的电解质，中和胶粒电性，降低双电子层的排斥力，导致胶粒的相互碰撞。•另外，由于电解质在水中的水化作用，会破坏胶粒周围的水化层，促使胶粒碰撞、聚集、沉降。凝聚剂种类：•硫酸铝Al2(SO4)3·18H2O(明矾)、•氯化铝AlCl3·6H2O、三氯化铁FeCl3·6H2O、硫酸亚铁FeSO4·7H2O、石灰、ZnSO4、MgCO3等。机理：A、破坏双电层，B、水解后胶体吸附，C、氢键结合等。2020/1/1715（一）凝集和絮凝方法2、絮凝•在高分子絮凝剂的作用下，通过桥架作用使粒子相互作用形成较大的絮凝团的过程。•本质：悬浮粒子与絮凝剂之间的桥架作用。2020/1/1716絮凝现象与原理絮凝剂菌体细胞废水处理•絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，具长链状结构，其链上含有许多活性功能团，包括带电荷的离子基团和不带电荷的非离子型基团。絮凝剂种类：①有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；②无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；③天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖等。机理：絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用2020/1/1719复合型生物絮凝剂凝聚和絮凝是两种方法，两个概念。凝聚：投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）中和胶体的电荷，使粒子相互聚集成１mm大小块状凝聚体的过程。絮凝：使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。凝聚：胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）机理：a中和粒子表面电荷b消除双电层结构絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，形成絮凝团的过程机理：架桥作用凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使其聚集起来,增大体积以便固液分离,常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中.2020/1/1723（二）加热法前提：产物的热稳定性高目的：降低发酵液黏度–加速凝聚作用–除去热变性蛋白–破坏凝胶状胶体稳定性–增加滤饼空隙率2020/1/1724（三）调节pH值法•促进絮凝和凝聚作用•释放或稳定产物，防止其氧化、变性或沉淀。•调节pH值时应防止过酸或过碱（四）加水稀释法提高后续的离心沉降速度2020/1/1725不同pH值条件下小球藻具有不同的悬浮特性2020/1/1726（五）加入助滤剂法•防止滤布或生成的滤饼阻塞而影响过滤。•常用的助滤剂：–纸浆–石棉–活性炭–硅藻土–酸性白土2020/1/1727（六）加吸附剂或盐•吸附细胞•常用的吸附剂有磷酸氢二钠和氯化钙形成的CaHPO4凝胶、氧化铝凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等。􀂄发酵液中的杂质不仅直接影响产品质量和收得率，同时对后继提取和精制有很大影响。􀂄高价无机离子（Ca2+、Fe2+等）􀂄可溶性蛋白质多糖的去除有色物质的去除（七）发酵液的相对纯化1.无机离子的去除Ca2+、Mg2+、Fe2+等（如何去除？？）（1）Ca2+——加草酸钠沉淀C2O4Na2+Ca2+→C2O4Ca↓+2Na+（2）Mg2+——加三聚磷酸钠形成络合物Na5P3O10+Mg2+→MgNa5P3O10+2Na+（3）Fe2+——加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+高价无机离子的去除利用各种沉淀方法，可以去除液相中各种蛋白质。常用的有等电点沉淀法、变性沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、反应沉淀法等。这些沉淀方法既可以作为除杂质的方法，也可以作为提取目标产物的技术手段。2．杂蛋白的去除酶解法可将混合液中的不溶性多糖物质酶解，使其转化为溶解度较大的单糖，从而改变流体的流动特性，提高过滤速率。3．多糖的去除发酵液中有色物质可能是由于微生物生长代谢过程分泌的，也可能是培养基（如糖蜜、玉米浆等）带来的，色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。有色物质如何去除？4．有色物质的去除•色素物质的去除，一般以使用离子交换树脂、离子交换纤维、活性炭等材料的吸附法来脱色最为普遍。•一般发酵液的脱色往往是在过滤除去菌体后进行。活性炭可用于油脂、饮料、食品、饮用水的脱色、脱味。活性炭是一种由含炭材料制成的外观呈黑色，内部孔隙结构发达、比表面积大、吸附能力强的一类微晶质碳素材料。活性炭材料中有大量肉眼看不见的微孔。活性炭脱色（1）活性碳一般使用温度是75-80度比较好；（2）活性炭脱色效果在水中最强，在强极溶剂中使用效果也不错，在非极性溶剂中效果较差；（3）一般情况下，在pH3-6条件下使用较好；（4）一般情况下，加入量为0.1—3％（W／V）；（5）脱色时间一般为30-60min；注意事项：（1）切不可在沸腾的溶液中加入活性炭，那样会有暴沸的危险。（2）用活性炭脱色要待固体物质完全溶解后才加入。活性炭脱色原理和操作活性炭净化空气活性炭除甲醛固液分离胞外上清液/滤液提取生化物质的第一步，分两部分：胞内富集细胞第二节细胞分离•大部分工业生物分离的第一步往往是将不溶物质从发酵液中除去。这些不溶性固体的浓度和颗粒大小的变化范围很宽。•浓度可高达每单位体积含60%的不溶性固体，又可低至每单位体积仅含0.1%。•粒径的变化可以从直径约为1um的微生物，到直径为1mm的不溶性物质。•对于浓度较小，粒径较大，硬度较强的不溶物，我们可以采用过滤方法分离。•与过滤设备相比，离心设备的价格昂贵。但当固体颗粒细小而难以过滤时，离心操作往显得十分有效。•当静置悬浮液时，密度较大的固体颗粒在重力作用下逐渐下沉，这一过程称为沉降。离心产生的固体浓缩物和过滤产生的浓缩不同：通常情况下离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体；而过滤可获得水分含量较低的滤饼。但是，对大多数生物发酵液可以离心但不能有效地过滤分离，所以离心往往是很有效的方法。43常见的细胞分离方法•重力沉降•离心沉降•过滤当一固体微粒通过无限连续介质时，它的运动速度受两种力的影响：浮力作用流体阻力作用一、颗粒沉降（Sedimentation）什么情况下颗粒在流体中会发生沉降过程？（一）重力沉降由地球引力作用而发生的颗粒沉降过程，称为重力沉降当一个球形颗粒放在静止流体中，颗粒密度大于流体密度时，则颗粒将在重力作用下作沉降运动。设颗粒的初速度为零，则颗粒最初只受重力Fg与浮力Fb的作用。重力向下，浮力向上。Fb浮力Fg重力根据沉降作用力可分为：重力沉降、离心沉降（一）重力沉降当作用于颗粒上的这两个外力之和不等于零时，颗粒将产生加速度。当颗粒开始下沉时，受到流体向上作用的阻力。Fb浮力Fd阻力Fg重力根据牛顿第二定律，可得到颗粒直径为d、颗粒密度为ρs的重力沉降运动基本方程式：（1）球形颗粒的自由沉降速度gdFs3g6重力：（a）gdF3b6浮力：（b）tuu0加速段匀速段颗粒做匀速运动，沉降速度恒定不变，该速度称为自由沉降速度。达到恒定的沉降速度时，合力为：042662203s3madugdgdF42220dduF阻力：（c）阻力系数Fb浮力Fd阻力Fg重力042662203s3madugdgdF34s0gdu（球形颗粒的自由沉降速度）（2）阻力（曳力）系数（Dragcoefficient）与流体的流动阻力系数类似，阻力（曳力）系数与颗粒沉降雷诺数有关，即)(Re0f00Redu注意：其中d为颗粒直径，u0为颗粒的沉降速度，ρ、μ分别为流体的密度与粘度。•依靠离心力的作用，使流体中的颗粒产生沉降运动，称为离心沉降。适于分离两相密度差较小，颗粒粒度较细的非均相物系。•由重力沉降可知，当颗粒较小时，其沉降速度小，需要较大的沉降设备。为了提高生产能力，可使用离心沉降。因为离心力可比重力大千倍或万倍。（二）离心沉降颗粒离心沉降的速度方向是由圆心沿径向指向外周，但由于颗粒和流体同时做圆周运动，颗粒的实际运动轨迹是一个半径逐渐扩大的螺旋线。离心沉降速度并不是颗粒的实际运动速度，只是其在径向上的分量。r1r2ArCBuruut颗粒在旋转流体中的运动（1）球形颗粒的离心沉降速度（u）重力场离心力场力场强度重力加速度gut2/R方向指向地心沿旋转半径从中心指向外周Fg=mgRumFTC2作用力惯性离心力场与重力场的区别沉降速度恒定变化离心加速度（离心力场强度）直径为d的球形粒子在流体中作匀速圆周运动，切线速度为uT；径向速度ur；旋转半径为R粒子密度为ρs；流体密度为ρ惯性离心力（与重力相当）:向心力(与重力场中的浮力相当):阻力(与颗粒径向运动方向相反):径向受力分析RudTs236RudT2362422rud（指向中心）（指向中心）uruTuR（中心指向外周）三力达到平衡，则：RudTs236RudT23602422rud平衡时颗粒在径向上相对于流体的运动速度ur便是此位置上的离心沉降速度（绝对速度在径向上的分量）。RuduTsr234——离心沉降速度表达式gdust3)(4——重力沉降速度表达式两者区别在于加速度的不同，一个是“ut2/R”，一个是“g”。（2）离心分离因数（Kc)同一颗粒在同一种介质中的离心沉降速度与重力沉降速度的比值为：cTtrKgRuuu2比值Kc就是粒子所在位置上的惯性离心力场强度与重力场强度之比称为离心分离因数。例如；当旋转半径R=0.4m，切向速度uT=20m/s时，求分离因数。1022gRuKTc分离因数是离心分离设备的重要指标。某些高速离心机分离因数值可高达数十万。旋风或旋液分离器的分离因数一般在5～2500之间。表明离心沉降速度是沉降速度的百倍，因此离心沉降设备分离效果远高于重力沉降设备。原理离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。•动植物细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。二、离心分离法离心力与离心转速的换算RCF和rpm之间可以相互换算rpm—revolutionsperminute，每分钟转数，r/minRCF—relativecentrifugalforce，相