第二章 细胞分离与破碎

1第二章细胞分离与破碎2总体学习目的和要求通过本章学习，要求掌握细胞分离和目标产物释放的原理和影响因素，熟知各种方法的优缺点和应用范围。4•收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等）。•收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。一、固液分离的目的5二、**影响发酵液固液分离的因素1）发酵液中悬浮离子的大小62）发酵液的黏度（viscosity）固液分离速度通常与粘度成反比，粘度越大，固液分离越困难。影响粘度的因素：菌体的种类和浓度（重要因素）培养液中蛋白质、核酸大量存在培养基成分此外，某些染菌发酵液，如染细菌，则粘度会增大7三、常见的固液分离方法•重力沉降gravitationsettling•离心沉降Centrifugationsettling•过滤filtration8重力沉降在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。在生物分离过程中，定义的颗粒为细胞、细胞碎片等有形物。（一）重力沉降gravitationsettling17•离心沉降在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。（二）***离心沉降Centrifugationsettling18应用•1878年瑞典牛奶——奶油•1896年用于回收酵母•离心分离技术在生工方面主要用于：分离DNA、大分子、菌体、动植物细胞、胞内产物。19优点：•时间短，对于不稳定的产物可以首选•可连续操作•操作费用较低•可用夹套控温缺点：•产品要及时移出•设备昂贵、维护费用高•连续生产应注意堵塞问题1***离心分离的优缺点202离心力与转速rrpmRCF(g)213***提高离心沉降速度的主要措施d－颗粒直径；ρS－固体颗粒密度；ρL－液体介质密度；µL－液体介质粘度；ω－旋转角速度；r－转轴中心到颗粒中心距离•增大dp•增大ρS•提高离心机转数N•提高离心半径r•降低液体粘度2L18)(2rdvLSPs22按速度和离心力：1、常速离心机最大转速8000rpm(r/min)，相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机1×104-2.5×104rpm，相对离心力104-105g，用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机转速2.5-8×104rpm，相对离心力5×105g；用于DNA、RNA、蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。4离心机的种类与用途23（1）差速离心分离法24核糖体，微粒体，高尔基体线粒体，溶酶体等细胞核，未破碎细胞组织匀浆600g×10min15,000g×5min100,000g×60min差速离心分离应用实例25（2）区带离心分离31按离心机的作用方式：–斜角式–平抛式–管式–蝶式–螺旋式32（1）斜角式离心机是一类结构最简单的实验室常用离心机。33平抛式离心机转子（2）平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在3000-6000rpm。34（3）管式离心机（tubular-bowlcentrifuge）3536**管式离心机特点：•结构简单。•管状离心机可以安装冷却夹套，有利蛋白质分离。•固体挂壁多时，可采用多台交替操作。•适用于于分离乳浊液及含细颗粒的稀悬浮液，适用于固体含量低于1%，颗粒度小于5微米，黏度大的悬浮液澄清或固液两相密度差较小的分离。37工作原理（4）碟片式离心机（disk-bowlcentrifuge）38（5）螺旋式离心机（scroll-typecentrifuge）•连续操作的沉降设备。•转鼓内有可旋转的螺旋输送器，其转数比转鼓的转数稍低。•有立式和卧式两种，卧螺机是一种全速旋转，连续进料、分离和卸料的离心机，最大离心力可达6000，操作温度可达300℃。•用于分离含固量较多的悬浮液，生产能力较大。39卧式螺旋式离心机07S0041-4440卧螺机内部结构41螺旋式离心机工作原理43细胞分离－常用离心设备带有灭菌装置的排渣碟片式离心机加压喷嘴型碟片离心机，用于酵母和细菌的分离445***离心机的选用原则•颗粒的大小、形状及硬度•原料液的组成、密度及粘度•产物热敏性45（三）过滤filtration过滤操作是借助于过滤介质，在一定的操作压力ΔP作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。–过滤介质filtermedium:过滤采用的多孔物质。46***（1）过滤推动力：•悬浮液自身压强差、重力•悬浮液的—外加压力•过滤介质的—抽真空•离心力***（2）过滤阻力：•介质阻力•滤饼阻力•大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼阻力。47（3）过滤速率cmLRRpAdtdQRm表示介质的阻力；Rc表示滤饼的阻力；μL为滤液的粘度49典型过滤设备：按操作方式分类：间歇过滤机、连续过滤机按操作压强差分类：压滤、吸滤和离心过滤实验室用抽滤装置板框压滤机（间歇操作）转筒真空过滤机（连续操作）过滤式离心机（5）固液分离过滤设备50实验室用抽滤装置52板框压滤机plateandframefilter54**板框压滤机优点过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。56真空转鼓过滤机（rotary-drumvacuumfilter）57•1-转鼓；2-过滤室；3-分配阀；4-料液槽；5-摇摆式搅拌器；6-洗涤液喷嘴；7-刮刀58优点：•转鼓真空过滤机可吸滤、洗涤、卸饼、再生连续化操作，生产能力大，劳动强度小。缺点：•辅助设备多，投资大，•且由于真空过滤，推动力小（不超过8×104Pa），滤饼湿度大（20％～30％）。•主要适用霉菌发酵液，对菌体细小、黏度大铺助滤剂。对于滤饼阻力较大的物料适应能力较差。**转鼓真空过滤机61结构：转鼓滤饼滤布滤网离心过滤机工作原理图转鼓(上有小孔，亦称悬框)；滤网；滤布；机架。原理：由于离心力作用，液体产生径向压差，通过滤饼、滤布及滤网而流出。离心过滤机（centrifugalfilter）63第四章细胞破碎•掌握：各种细胞破碎方法、原理、优缺点及其适用范围。•应用：采用不同的细胞破碎方法对细胞进行不同程度的破碎。64一、概述大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。脂类物质和一些有用酶包含在生物体中。65细胞破碎（cellrupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。66二、常见细胞壁的结构细菌酵母霉菌葡聚糖糖蛋白蛋白质几丁质68机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎有机溶剂表面活性剂酸碱酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的撞击力、剪切力使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞壁结构受到破坏，而达到细胞破碎三、***细胞破碎方法及其原理69（一）机械法机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠磨破碎法（beadgrinding）超声波破碎法（ultrasonication）70采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。1高压匀浆法（High-pressurehomogenization）阀座撞击环阀杆阀杆压力控制手轮APVMantonGaulin高压匀浆器针型阀结构简图（1）工作原理71高压匀浆器各种阀型设计刀型阀锥型阀球型细胞破碎阀锯齿阀细胞破碎阀标准阀高压匀浆机72（2）***高压匀浆法适用的范围—大规模细胞破碎的常用方法☆高压匀浆法适用的范围酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。☆不宜使用高压匀浆法易造成堵塞的团状或丝状真菌；较小的革兰氏阳性菌；含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）。73(3)***影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：ln[1/(1-S)]=kPɑNb式中S—破碎率；N－循环次数；P－操作压力，MPa；752珠磨法beadmillWSK卧式高效全能珠磨机76（1）高速珠磨机工作原理78（2）***影响珠磨机破碎的因素破碎作用符合下列公式：ln[1/(1-S)]=ktS—破碎率；k—破碎速率常数；t—停留时间。k与搅拌转速、细胞悬浮液浓度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。82机理JY92-IID超声波细胞破碎机一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation)。3超声波破碎Ultrasonication84技术原理效果成本破碎率举例高压匀浆法(孔型)高速撞击、剪切、压力骤降剧烈适中50%酵母、细菌细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法玻璃珠或铁珠剪切碰撞剧烈便宜90%多种菌体、细胞的大规模处理超声波法超声波的空穴作用适中昂贵50%细胞悬浮液小规模处理不同机械破碎方法的比较85非机械方法很多1酶解2化学法溶胞3物理法–渗透压冲击–冻融法其中酶法和化学法溶胞应用最广。二（二）非机械破碎方法861酶解（酶溶法Enymaticlysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。87溶菌酶89某些化学试剂可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。2化学渗透法（Chemicalpermeation）91渗透压冲击法冻融法3物理法94**机械法和非机械法破碎的比较比较项目机械法非机械法破碎机理碎片大小内含物释放粘度时间，效率设备通用性经济应用范围剪切细胞碎片细小全部高（核酸多）时间短，效率高需专用设备强成本低工业规模，实验室溶解局部壁，膜细胞碎片较大部分低（核酸少）时间长，效率低不需专用设备差（专一性强）成本高实验室，部分工业96四、**选择性释放目标产物的一般原则(1)仅对目标产物的位置周围破碎(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。97讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究一.化学法20%(W/V)大肠杆菌悬浮液+B.A37℃搅拌高速离心测上清液酶活1.处理时间R%3h2.丁酯用量条件：37℃，搅拌3小时适宜的B.A加量为12%，释放率R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活98二.化学法—冻融法结合加B.A(12%,37℃搅拌3h）菌悬液冻融(冻结14h融化)释放率—70%；比活—2.69u/mg三.化学—超声波振荡法结合先丁酯处理，再超声波（90秒），释放率72%小型设备，不能工业大规模生产。四.高压匀浆法20%(W/V)菌悬液，ΔP=50MPa，N=3。释放率R=38.4%，原因:细胞破碎后,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。五.高压匀浆—化学法结合先高压匀浆，再加10%丁酯，37℃搅拌3h，高速离心(3万rpm)，释放率：R=60%六.珠磨直径0.4mm玻璃珠。释放率：R=95%100七、破碎技术的研究方向多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。有机溶剂与冻融法结合101破碎技术的研究方向-与上游过程相结合在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂，继续培养后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；选择较易破碎的菌种作为宿主细胞；用基因工程的方法对菌种进行改造。102破碎技术研究方向-与下游工程相结合举例