蛋白序列测定

第三节蛋白质的一级结构蛋白质的相关概念肽的命名、书写及特点测序过程一、相关概念1.蛋白质的一级结构（Primarystructure）:又称为共价结构或化学结构。它是指蛋白质中的氨基酸（残基）的种类、排列顺序及连接方式。特点：①具有部分双键的性质,不可以旋转②肽键比一般的碳-氧键短；③与肽键相连的氢原子和氮原子呈反式；2.肽键(peptidebond)一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基缩水形成的酰胺键（共价）键，称为肽键。3.肽(peptide)一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩水形成的化合物，称为肽。在蛋白质分子中，氨基酸借肽键连接起来，形成肽链。肽和肽键的形成肽单位肽键肽平面4.残基(residue)肽链分子中的每一个氨基酸，由于相互连接而失去一分子水，与原来的结构相比，分子稍有残缺，因此通常把肽链分子中的每一个氨基酸单位称为氨基酸残基(128/110).二、肽的命名及书写1.命名：习惯：按数量的多少、按来源系统：某氨基酰某氨基酰……某氨基酸2.书写：从N(H)到C(OH)，具方向性三字母符号或单字母符号表示，中间用“·”或“-”表示。例如:Gly-Glu-Lys-Ala(甘氨基酰谷氨基酰赖氨基酰丙氨酸)当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在N端仍然有游离的氨基和C端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽和多肽。多肽仍然有游离的α-氨基和α-羧基。少于10AA称为寡肽，多于10AA称为多肽或聚肽。分子量大于10000d称为蛋白质，小于10000d称为多肽。•在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。•但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。•实例：谷胱甘肽(glutathione,GSH)•短杆菌肽;脑啡肽；•促甲状腺素释放因子（TRH）•-天冬氨酸-苯丙氨酸甲酯（甜味剂）•激素类多肽；抗生素类多肽；蛇毒多肽等。重要的肽GSH的作用解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态；维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。3.肽的理化特点：①肽键的酰氨氢不解离，肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端α-NH2、α-COOH及侧链R基上的可解离基团；②肽中末端α-羧基的pKa值比游离氨基酸的大，末端α-氨基的pKa值比游离氨基酸的小(?)；③游离的α-氨基、α-羧基和R基可发生与氨基酸中相应的类似反应，如茚三酮反应等；④蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋，则具有旋光性，短肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和，较长的肽的旋光度则不是简单加和。二、蛋白质一级结构测定步骤测序前提：样品必须是均一的(纯度大于97%)必须知道它的相对分子量，其误差允许在10%以内1.测定蛋白质分子中多肽链的数目2.拆分蛋白质分子的多肽链3.断开链内二硫键4.分析每条多肽链的氨基酸组成比及数目5.鉴定多肽链的N、C瑞残基6.裂解多肽成小的肽段7.测各肽段的氨基酸序列8.重建完整多肽链的一级结构9.确定二硫键的位置测序过程(一)N末端测定二硝基氟苯（DNFB）法：肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽→黄色DNP-氨基酸丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸苯异硫氰酸（PITC）法：生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来氨肽酶法：外切酶，但效果不好氨肽酶法氨肽酶是一类外切酶，它从肽链的N末端逐个向里切。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶也会遇到N末端氨基封闭，用焦谷氨酸氨肽酶处理。C-末端测定肼解法：最重要的化学方法，肽与肼反应，除C-末端氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物还原法：C-末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的α-氨基醇羧肽酶法：最有效、最常用羧肽酶A羧肽酶B羧肽酶Y羧肽酶C氨基酸酰肼可以与苯甲醛作用变成水不溶性二苯基衍生物而沉淀GlnAsnCys等不易测出，末端Arg变成鸟氨酸羧肽酶法本方法目前最有效。从羧基端开始向里逐一水解蛋白质羧肽酶A：释放除Pro，Arg和Lys以个的所有C-末端残基羧肽酶B：只水解以碱性Arg和Lys为C-末端的肽键羧肽酶C：羧肽酶Y：可以作用于任何一个C-末端残基二硫键的断裂氧化法：过甲酸还原法：巯基化合物还原（β-巯基乙醇，二硫苏糖醇等）此外还需要加8mol/L尿素或6mol/L的盐酸胍，使蛋白质变性。生成的巯基要用碘乙酸等烷化剂保护。(三)氨基酸组成的测定：酸水解：是主要方法，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部分破坏，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu,同时释放出NH3；碱水解：多数氨基酸都被破坏，但Trp可定量回收(四)多肽链的部分裂解酶裂解胰蛋白酶：专一性强，断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键糜蛋白酶：断裂Phe，Trp，Tyr，Leu等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键嗜热菌蛋白酶：专一性差，断裂Val，Leu，Phe，Tyr，Trp等氨基参与形成的肽键胃蛋白酶：在酸性条件稳定，肽键两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时常用，专一性与糜蛋白质酶类似化学裂解溴化氰（CNBr）：只断裂Met羧基形成的肽键羟氨（NH2OH）：在pH9时，专一断裂Asn-Gly之间的肽键，其它条件下不专一今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是Lys，Pro,Arg,Phe,Ala,Tyr和Ser，该肽未经糜蛋白酶处理时，与DNFB反应不产生α-DNP-氨基酸，经糜蛋白酶作用后，此肽断裂成两肽段。其氨基酸组成分别是Ala,Ser,Tyr和Lys，Pro,Arg,Phe。这两个肽段分别与DNFB反应可分别生成DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应，同样能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg,Pro和Phe,Tyr,Lys,Ser,Ala。试问此七肽的一级结构序列是怎样？(五)肽段的氨基酸测序Edman化学降解法：用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各种层析技术分离；现改用蛋白质测序仪。酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难质谱法：质谱仪由核苷酸序列推定法：mRNA，cDNA，推出cDNA的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列(六)肽段在多肽链中次序的决定(七)二硫键位置的确定：对角线电流法：一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换反应。对角线电泳过程：把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在pH6.5条件下进行第一向电泳，肽段将按大小及电荷不同分离开，然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使S-S氧化成一对含磺酸基丙氨酸的肽。滤纸旋转90度，在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。这时大多数氨基酸的迁移率未变，将位于滤纸的一条对角线上，而含磺基丙氨酸的成对肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。问题：有一个A肽，经酸水解分析得知由Lys、Asp、Glu、Arg、Ala、Val和Tyr组成。当A肽与DNFB反应后，得DNP-Glu，当用羧肽酶处理后得游离Asp。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到三个肽，其中一种(Arg、Gln、Tyr),在pH6.4时净电荷为+1，另一种(Ala、Lys)第三种为（Val和Asn）在pH6.4时，带电荷为零。此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得以两种肽，一种(Gln、Tyr、)在pH6.4时不带电荷，另一种(Arg、Ala、Val、Lys、Asn)在pH6.4时带2个正电荷，问A肽的序列如何？详细写出推理过程。作业：•1名词解释•蛋白质的一级结构(proteinprimarystructure）、肽和肽键•2裂解多肽链的部分方法有哪些，各有何特点？