蛋白样本制备与Western Blot

CompanyLOGO蛋白样本制备与WesternBlot主要内容蛋白样本制备的目的1蛋白样本制备总体原则和策略2案例分析—细胞总蛋白的提取3成功的WesternBlot6蛋白提取产品选择指南4蛋白定量方法的选择5一蛋白样本制备---成功蛋白分析的基础蛋白样本activityassaysproteinmicroarraysSDS-PAGE/IEFimmunoblottingmassspectrometry2-DEEMSAELISA蛋白样本制备的目的:后续应用二蛋白样本制备的原则蛋白样本制备原则方法应具备标准化，具有重现性、可靠性、简便性；尽量抽提完全；应使所有蛋白全部处于溶解状态防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性防止在抽提过程中发生化学修饰如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。二蛋白样本制备的策略制备蛋白的目的活性分析免疫印迹杂交免疫沉淀或共沉淀1D2DEMSACHIP等实验材料细胞组织固定组织或石蜡包埋组织微生物酵母植物提取RNA后的剩余的蛋白样本等目的蛋白的结性质与分布分布于胞桨/胞核/膜可溶/不可溶含量多少分子量大小四级结构特征磷酸化等修饰……方法的选择1自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取2购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取三案例分析--细胞中总蛋白的制备高速离心收集上清即得全蛋白样本细胞加入裂解液冰上放置10-15分钟蛋白定量和SDS-PAGE检测裂解样品离心收集定量检测细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活性剂缓冲液蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它：H2O、NaCl、等还原剂RIPABuffer细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点缓冲液Tris-HCl（pH7.5),提供pH环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点表面活性剂溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（如NP-40、Triton-100、tween系列等）。各类表面活性剂特点1阴离子型:SDS脱氧胆酸盐2阳离子型:CPB和CTAB3双性离子型:CHAPSZwittergent系列4非离子型:Brij系列Triton-100NonidetP40Tween系列等CompanyLogo选用表面活性剂考虑的因素参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂选用表面活性剂考虑的因素工作条件下表面活性剂的溶解性使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类考虑表面活性剂的去除方法表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量保护蛋白活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度尽量使用毒性较低的表面活性剂因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进行蛋白的后续分析去除未结合的表面活性剂1疏水吸附方法HydrophobicAdsorption2透析法Dialysis3凝胶层析法GelChromatography4离子交换层析Ion-exchangeChromatography根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目,和电荷等性质来去除.细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入蛋白酶抑制剂及其鸡尾酒细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点磷酸酶抑制剂抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入。磷酸酶抑制剂选择磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：PP1,PP2A,PP2B）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。常规的抑制剂主要包括：试剂名称抑制作用氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶正钒酸钠碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠丝氨酸-苏氨酸磷酸细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点还原剂防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、β－巯基乙醇等。.细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点其它水；溶剂NaCl：全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘油,稳定蛋白注意事项可以适量加入Benzonase/DNaseI等核酸酶,去除DNA,充分提取蛋白,降低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷酸酶使用的Detergent的种类纯度浓度干扰去除等因素Temperature试剂和器皿冰上预冷,低温4℃操作细胞或组织的样本量裂解液的用量细胞裂解液-RIPABuffer的配方分析及技术要点四蛋白样本制备产品选择指南核蛋白样本制备抽提原理低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与胞核;离心分离出胞核;高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解DNA,释放出DNA结合蛋白(组蛋白和转录因子)实验注意事项试剂和器皿冰上预冷裂解液的用量细胞总量抑制蛋白酶蛋白酶抑制剂膜蛋白样本制备膜蛋白的抽提方法及原理方法多直接抽提法分级抽提法1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提2:按溶解性分级抽提3:按亚细胞分级抽提产物细胞膜蛋白细胞器质膜蛋白注意事项根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂变性剂等.抑制蛋白酶.样本量膜蛋白的直接提取蛋白的分级提取按蛋白溶解度不同进行分级抽提,降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白(膜蛋白)；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。亚细胞分级抽提用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。根椐胞浆/胞膜/胞核/骨架蛋白的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解四种亚细胞组分分离提取的结果线粒体蛋白样本制备首先用密度梯度离心方法分别分离出线粒体,胞质,胞核.再用线粒体抽提Buffer溶解线粒体蛋白.其它蛋白抽提产品高丰度蛋白去除试剂盒信号蛋白提取试剂盒糖蛋白提取试剂盒细菌蛋白提取试剂盒酵母蛋白提取试剂盒植物蛋白提取试剂盒五蛋白定量产品选择指南BCA法蛋白定量BCA（bicinchoninicacid）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，TritonX-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。Bradford法蛋白定量考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此法的测定。Lowery法蛋白定量Lowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。六成功的WesternBlotDiagram通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白原理六成功的WesternBlot二抗孵育蛋白提取与定量一抗孵育封闭转膜SDS-聚丙烯酰胺电泳蛋白变性显影蛋白变性Tris-cl(PH6.8)SDSGlycerolBromphend-blueβ-巯基乙醇DTT高温变性,形成蛋白质-SDS胶束急速冷却，防止复性加入Samplebuffer沸水浴15min冰浴30minSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳产物：三维网状结构凝胶加速剂催化剂单体交联剂缓冲液Tris-Cl四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（Acr）过硫酸胺或核黄素（AP）甲叉双丙烯酰胺（Bis）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中各种成分的作用十二烷基硫酸钠(SDS)SDS是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，再与PAGE技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量。甘氨酸样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界,而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液试验中各种成分的作用蛋白上样缓冲液(SDS-PAGEloadingbuffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。上样缓冲液（含一定量的DTT或巯基乙醇）中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带。其作用增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。指示剂检测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中各种成分的作用转移缓冲液中都含有适量的甲醇，一般用的甲醇浓度是10%-20%，低浓度5%-10%是可以提高大分子的转膜效率，而高浓度30-40%时可以提高小分子的转膜效率。甲醇可以降低电导，防止溶液过热，其实乙醇也可以。对于分子量较小的蛋白质，甲醇能促进它们固定在固相纸膜上，但对于大分子量蛋白质，尤其是碱性蛋白质，在转移缓冲液中是不宜加入甲醇的。因甲醇使凝胶孔径变小，不利于分子量较大的蛋白质从凝胶中转移出。由于甲醇能将结合在碱性蛋白质上面的SDS解离出来，而使其带正电或呈电中性，蛋白质也就更难从凝胶中转移出甲醇SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳过硫酸铵和TEMED试验中各种成分的作用激活剂的浓度适当与否不仅可以决定凝胶聚合的速度，也将影响凝胶的质量。增加过硫酸铵或TEMED的用量，将使丙烯酰胺聚合链长度缩短，凝胶会变得脆弱而失去应有的柔性。二者多至一定程度时，聚合链长度过短，将不会形成肉眼可见的凝胶，这些短链多聚物呈溶液状，只是其粘度较聚合前高一些。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩PH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离PH8.8Tr