胜红蓟黄脉病毒福建烟草分离物F2及其编码的C5基因的分子鉴定

福建农林大学硕士学位论文胜红蓟黄脉病毒福建烟草分离物F2及其编码的C5基因的分子鉴定姓名：刘舟申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：吴祖建20070401胜红蓟黄脉病毒福建烟草分离物F2及其编码的C5基因的分子鉴定作者：刘舟学位授予单位：福建农林大学相似文献(10条)1.期刊论文熊庆.周雪平.XIONGQing.ZHOUXue-ping假马鞭曲叶病毒和中国胜红蓟黄脉病毒C4蛋白是RNA沉默的抑制子-微生物学报2007,47(1)为了研究中国胜红蓟黄脉病毒(AgeratumyellowveinChinvirus,AYVCNV)和假马鞭曲叶病毒(Stachytarphetaleafcurlvirus,StaLCV)C4蛋白的功能,利用烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus,TRV)载体在本氏烟(Nicotianabenthamiana)中分别表达了这两种病毒的C4蛋白,结果发现它们均能在本氏烟中引起类似于病毒侵染的症状,推测AYVCNV和StaLCV的C4蛋白是病毒的致病因子;在RNA沉默的抑制试验中,AYVCNV和StaLCV的C4蛋白均能够在表达gfp基因的转基因本氏烟(16c)上抑制由gfp基因正义链引起的基因沉默的建立,证明它们都是RNA沉默的抑制子.2.学位论文张鹏程胜红蓟黄脉病毒F1分离物伴随卫星小分子DNAβ的启动子鉴定2009双生病毒在世界范围内广泛发生，并已在多种作物上造成毁灭性危害，国内已报道和鉴定了30多种双生病毒。本文以福建省首例发现的胜红蓟黄脉病毒AYVV(登录号EF544600)为研究对象，通过双生病毒卫星小分子DNAβ的通用引物，PCR扩增获得AYVV-[F1]的完整DNAβ分子。经克隆、序列测定和生物信息学分析，结果表明AYVV-[F1]DNAβ组分全长1346个核苷酸，与台湾番茄曲叶病毒TLCVDNAβ(登录号AJ542495)的同源性最高，达100％。根据F1DNAβ的全长序列设计特异性引物F1-βC1-F和F1-βC1-R对βC1基因进行了克隆后再将该基因插入到原核表达载体pGEX-4T-3中。重组表达载体pGEX-F1-βC1转化至大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后进行表达，SDS-PAGE结果表明F1βC1基因得到了正确表达。此外，根据F1DNAβ基因组的序列设计特异性引物对F1DNAββC1ORF的大小为803nt的部分启动子序列进行了克隆，同时利用PlantCARE程序对βC1ORF启动子序列进行分析，在其内部发现了一些真核启动子中常见的顺式作用元件，如TATA-box，CAAT-box和GC-motif，同时发现了其他的一些植物调控元件。随后根据βC1ORF启动子上顺式作用元件的位置设计了多个不同大小的缺失启动子，并由这些缺失启动子驱动egfp报告基因在烟草中进行瞬时表达和永久表达，鉴定了该启动子的启动活性。对瞬时表达的westernblot分析和荧光显微镜检查表明：AYVVF1βC1ORF翻译起始位点上游的173nt的片段具有基础启动子的活性，而在翻译起始位点的上游存在能够增强启动子活性的元件。利用荧光显微镜对经过PCR和PCRsouthernblot鉴定后的转基因植株组织表达模式的进行分析，表明F1DNAββC1ORF启动子是一种韧皮部特异性表达的启动子。3.学位论文张洁福建省两种双生病毒的致病机制研究2009本文对福建省杂草上的双生病毒进行了鉴定，并对其致病机制作了初步研究。从福建省福州地区采集了表现有典型双生病毒症状的野葛(Puerariamontana)病样，通用引物PA/PB对野葛样品进行了特异PCR检测，结果发现，样品中有大约500bp的条带，表明此野葛中极有可能含有双生病毒。随机选择了三个克隆Yg1、Yg2及Yg3进行序列测定，测序结果表明此三个克隆之间的差异极小，核苷酸序列同源性均在98.8％以上(登录号FJ539016，FJ539017和FJ539018)，说明此样品很可能是由同一种双生病毒侵染。在此基础上，我们对Yg3样品中的双生病毒的全基因组进行了研究。通过一对背靠背引物获得了Yg3的全基因组序列，测序表明，Yg3DNA-A全长2729nt(登录号FJ539014)，具有典型的粉虱传双生病毒特征：共编码6个开放阅读框(openreadingframes，ORF)，其中正义链编码2个ORFs，分别为AV1和AV2，反义链编码AC1、AC2、AC3和AC4四个ORFs，其茎环结构区含有TAATATTAC保守序列。经NCBI检索和BLAST比对发现，Yg3DNA-A与野葛花叶病毒DNA-A(Kudzumosaicvirus-[Vietnam：Hoabinh：2005]DNA-A，KuMV-[VN：Hoa：05]DNA-A，登录号DQ641690)同源性最高，为92.9％。用Beta01/Beta02特异引物并未发现有DNA-β存在，然而用TempliPhiTMKit试剂盒扩增得到2677bp的片段(登录号FJ539015)，NCBIBLAST比对发现其与野葛花叶病毒DNA-B(Kudzumosaicvirus-[Vietnam：Hoabinh：2005]DNA-B，KuMV-[VN：Hoa：05]DNA-B，登录号DQ641691)同源性最高，为81.7％。由此，我们确定Yg3为野葛花叶病毒(Kudzumosaicvirus，KuMV)的一个分离物，并将其命名为野葛花叶病毒分离物Yg3(KudzumosaicvirusYg3isolate，KuMV-Yg3)。Yg3DNA-B编码两个ORFs，即反义链上的BC1和正义链上的BV1，同时也含有保守序列TAATATTAC。为了研究KuMVDNA-A和DNA-B在致病中的作用，我们构建了KuMV-Yg3DNA-A和DNA-B的侵染性克隆，注射本氏烟(Nicotianabenthamiana)后发现，共同接种DNA-A和DNA-B的烟草叶片出现黄色褪绿斑点症状，而单独接种DNA-A或DNA-B的烟草中未出现任何症状。另外，我们对胜红蓟黄脉病毒福建烟草分离物F2(Ageratumyellowveinvirus-F2，AYVV-F2)的DNA-A(登录号EF527823)及其伴随DNA-β(登录号EF527824)及本实验室保存的一个缺陷型DNA-β(ADNA，登录号FJ605171)进行了侵染性克隆的构建，以期对其致病机制进行初步探讨。注射烟草后发现，AYVV-F2DNA-A+DNA-β或者AYVV-F2DNA-A+ADNA-β这两种组合都能引起本氏烟(Nicotianabenthamiana)及普通烟(Nicotianatobacum)轻微的黄脉症状。4.期刊论文钱亚娟.郭维.周雪平.QIANYa-juan.GUOWei.ZHOUXue-ping中国番茄黄化曲叶病毒DNAβ缺失突变体与异源病毒的互作研究-病毒学报2006,22(4)与一些单组份双生病毒伴随的卫星DNAβ是辅助病毒在自然寄主上引起典型症状所必需的致病相关分子.迄今发现的所有DNAβ分子在互补链上都含有一个位置和大小保守的βC1基因.对中国番茄黄化曲叶病毒的缺失βC1基因的DNAβ突变体(DNA△C1β)与异源病毒接种后的致病性及稳定性进行了研究.PCR和Southern杂交证实该突变体能利用赛葵黄脉病毒、烟草曲茎病毒、中国胜红蓟黄脉病毒、假马鞭曲叶病毒等多种异源双生病毒复制并系统侵染本氏烟.接种后65d内的PCR检测和序列分析显示,该突变体与其它辅助双生病毒接种后在寄主细胞中的复制是稳定的.5.学位论文杨彩霞福建省六种双生病毒的分子鉴定及RaMoVNSP互作蛋白的筛选2009双生病毒是一种呈孪生颗粒形态的植物单链环形DNA病毒，至今已在多个国家和地区的多种作物上造成毁灭性危害。自20世纪90年代起，在我国华南地区的作物及杂草上己相继发现了多种双生病毒。本文报告了福建省几种作物和杂草上的双生病毒的分子鉴定结果。从福建福州采集了八份表现矮化症状的普通烟样品，利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500bp的DNA-A部分片段的相似性高于95％。挑选分离物F3进一步进行DNA-A全序列测定，结果显示F3DNA-A(F3A)全长为2739nts(EF125190)。利用RCA鉴定出DNA-B分子，F3DNA-B(F3B)全长是2720nts(FJ874926)。核苷酸同源性比对发现，F3A与海南报道的苎麻花叶病毒的一个分离物(Ramiemosaicvirus，RaMoV，EU596959)相似性最高，为95.1％。因此，我们认为F3是RaMoV的一个分离物。这是首次有关RaMoV自然侵染烟草的报道。为进一步验证RaMoVF3分离物的致病性，我们构建了F3A和F3B的侵染性克隆。农杆菌接种实验发现，F3A单独能完成系统侵染本氏烟、普通烟、珊西烟、心叶烟、三生烟和番茄，但是不能诱导任何症状。混合接种F3A+B，可在本氏烟、普通烟、珊西烟和三生烟上诱导产生典型的双生病毒侵染症状。从福建福州烟田采集的表现曲叶、耳突、叶脉增厚和矮化症状的普通烟样品YC7中分离出F11和F12两种病毒。利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500bp的DNA-A部分序列，确定YC7为F11和F12不同病毒复合侵染。F11和F12全长分别是2741nts(FJ869907)和2754nts(FJ869908)。同源性比对发现，F11与报道的广东番木瓜曲叶病毒的分离物PaLCuGuV-[CN：Gd2：02](AJ558122)的核酸相似性最高，为97.3％；F12与胜红蓟黄脉病毒的台湾分离物AYVVTW-[TW：Tai：99](AF307861)的核酸相似性最高，为90.1％。利用引物β01/02找到F12的伴随卫星DNAp(F12β)，F12β全长1344nts(FJ869909)，与胜红蓟黄脉病毒台湾分离物伴随卫星AYVB-[TW：CHu：02](AJ542495)相似性最高，96.5％，说明F11和F12分别是PaLCuGuV和AYVV的一个分离物。以样品YC7为毒源，利用粉虱进行传毒，能在普通烟和心叶烟上引起曲叶、耳突、叶脉增厚和矮化症状。PCR检测表明，传毒烟草上存在F11和F12两种病毒和F12p分子。Fp1-Fp4分离物来自福建福州表现轻微的花叶和皱缩症状的圆叶矮牵牛。利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增，得到约500bp的DNA片段，它们间的的核苷酸相似性为97.5％，说明它们是同一种病毒的不用分离物。随机选择Fp1进行全序列测定及进一步分析。Fp1全长2828nts(FJ515896)，具有典型的双生病毒DNA-A的基因组结构。Fp1DNA-A全序列与中国江苏报道的番薯曲叶病毒的一个分离物SPLCV-[CN-Js：08](FJ176701)相似性最高，为92.1％，说明Fp1是SPLCV的福建分离物。据我们所知，这是首次报道SPLCV可以自然侵染圆叶矮牵牛。通过构建SPLCVFp1分离物的侵染性克隆，并进行致病性测定，结果表明，Fp1A不能侵染本氏烟。从福建漳州采集到表现明显黄脉症状的一点红(Fz1-Fz5)和野茼蒿(Fz6)等六个样品。从这些植物的叶片中提取总DNA并采用滚环复制扩增法检测。Fz1-Fz6扩增产物分别用限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、SacⅠ、XbaⅠ和SalⅠ处理。Fz1-Fz6酶切片段(EcoRⅠ切下的2.7kb，XbaⅠ切下的1.3kb)被测序，部分结果显示这些植物被同一种病毒侵染。选择Fz1进行进一步分析。Fz1全长2725nts(EU377539)，伴随的DNAp全长1337nts(FJ869906)，Fz1全序列与印度的夜香牛黄脉病毒分离物VeYVV-[IN：Mad：05](AM182232)的相似性最高，76.7％。根据双生病毒“种”的分类标准，Fz1是一个双生病毒新种，我们将这个双生病毒新种命名为一点红黄脉病毒(Emiliayellowveinvirus，EmYVV)。我们