His标签融合蛋白纯化步骤

1/3His标签融合蛋白纯化步骤（Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化法）1.缓冲液配制LysisBuffer1(undernativecondition)0.5mMTris.HCl0.5MNaCl5%(w/v)glycerol10mMImidazol100mg(1mg/ml)lysozyme(Purificationof6xHis-taggedproteinsfromE.coli)1%NonidetP40(NP40=IgepalCA-630)0.25%Tween20（orTriton100）0.02%NaN3(Optional)2tabletsofproteaseinhibitorcocktail(EDTAfree，Recommended)200µg(2µg/ml)RNaseA(Optional)1mg(10µg/ml)DNase1(Optional)50mMNaF(Optional)1mMNa3VO4(Optional)+ddH2Oto100ml,AdjustpHto8.0usingNaOH此lysisbuffer适用于从E.coli、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带His标签的蛋白质。仅在用于裂解E.coli细菌时，加入溶菌酶。Na3VO4是磷酸酶抑制剂，保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。NaF是酯酶抑制剂，保护脂蛋白不被酯酶降解。注意：当使用镍琼脂糖凝胶纯化带His标签的蛋白时，缓冲液中不能加EDTA，因EDTA能使镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。LysisBuffer2(underdenaturecondition)50mMTris-Cl8MUrea(or6MGu-HCl)10mMImidazole0.05%Tween20AdjustpHto8.0usingNaOHDialysis/TevcleavageBuffer50mMTris-Cl,pH8.0100mMNaCl(dependsonsolubilityofprotein)2.5%glycerol0.5mMEDTA0.5mMDTTorTCEP2/3缓冲液A：50mMTris.HCl0.5MNaCl5%glycerol0.05%Tween20用高浓度HCl调节pH值至8.0。缓冲液B（洗脱缓冲液）：50mMTris-Cl0.5MNaCl5%glycerol0.05%Tween20500mM咪唑用高浓度HCl调节pH值至8.0。缓冲液C（咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液A和缓冲液B按不同比例配制，配制比例如下（100ml总体积）：咪唑浓度缓冲液A(ml)缓冲液B(ml)0mM100010mM98220mM96450mM901060mM8812100mM8020150mM7030200mM6040250mM5050400mM2080各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45μm滤膜过滤备用。2.样品预处理：按每克湿重菌体/4~5mlLysisBuffer的比例充分悬浮离心收集的菌体，置-80ºC冰箱过夜；在4ºC融解菌体，vortex悬浮细菌，400w功率下，每个循环超声5s，冷却5s，每次10min，共循环2次破碎菌体；4℃、12000rpm离心30min，收集上清液或者用0.45μm滤膜过滤，并用低浓度NaOH调节pH至8.0待纯化。3/33.操作步骤介质平衡与亲和取1mlNi-NTA琼脂糖凝胶（金益肽TMNTA货号：JYT-M0007），置入15ml离心管中，2000rpm离心2min，移去上清液；加入5mlLysisBuffer，混匀，低速离心，去上清。加入4-5ml细胞（细菌）裂解液，置于混匀转盘，4ºC低速旋转1小时。(每个品牌的NI柱载量都不同，金益肽TMNI-NTA琼脂糖凝胶载量40mg/ml，请根据目标蛋白的浓度、分子量大小、及体积来选取适量的Ni-NTA琼脂糖凝胶)装柱1)将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。2)打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液管吸取已与样品亲和的介质，将介质加入到层析柱中；在4ºC静置10min，让介质自然沉降。3)从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验要求并非十分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片）。4)在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述步骤重新装柱；或不更换垫片，用细棒搅拌介质，使其疏松，再装入上端垫片。洗柱：用5~10倍介质体积含10mM咪唑缓冲液C洗去层析柱中未结合蛋白；保留洗涤液，待SDS-PAGE电泳检测无目的蛋白后，再将洗涤液丢弃。洗脱：用含20、50、250mM咪唑的缓冲液C分步洗脱，每个梯度2~3倍介质体积洗脱，分别收集洗脱样品，SDS-PAGE电泳检测蛋白质；注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。