10抗体酶 核酶 极端

第十章模拟酶核酶极端酶10.1模拟酶11.1.1模拟酶的概念模拟酶又称人工酶或酶模型，是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机制和立体化学的一门学科，是从分子水平上模拟生物功能的一门边缘学科。模拟酶是20世纪60年代发展起来的一个新的研究领域，是仿生高分子的一个重要的内容。用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生物体内的化学反应过程。酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等特点。酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂。研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。•模拟酶的酶学基础–酶的作用机制：过渡态理论–对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究2.模拟酶理论基础•超分子化学–主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补–超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结构和性质的实体，形成超分子–功能：分子识别、催化、选择性输出3．设计要点设计前：酶活性中心-底物复合物的结构酶的专一性及其同底物结合方式的能力反应的动力学及各中间物的知识3．设计要点设计中：为底物提供良好的微环境催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性4.模拟酶的分类和制备根据Kirby分类法–单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性–机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成–单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子按照模拟酶的属性主-客体酶模型胶束酶模型肽酶抗体酶分子印迹酶模型半合成酶主-客体模型1.环糊精模拟酶----水解酶的模拟环糊精的分子结构水解酶模型研究热点环糊精（CD）分子原来：在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，改善CD的疏水结合和催化功能现在，桥联环糊精和聚合环糊精，可得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用2.冠醚化合物的模拟酶冠醚水解酶模拟物胶束模拟酶单分子胶束酶模型胶束酶模型目前模拟酶的研究主要有以下几方面：1.模拟酶的金属辅基:有一类复合酶,除蛋白质外,还有含金属的有机小分子物质或简单的金属，叫做辅酶或辅基。辅基在催化反应中起着重要的作用。有一些研究工作就是模拟酶分子中的金属辅基。例如，模拟过氧化氢酶分子中的铁卟啉辅基，合成了分解过氧化氢的酶模型──三亚乙基四胺与三价铁离子的络合物。这个模型在pH9.5和25℃的条件下，其催化速率是血红蛋白或正铁血红素在同样条件下的一万倍。化学模拟生物固氮同样是模拟固氮酶的金属辅基。2.模拟酶的活性功能基酶分子中直接与酶催化反应有关的活性中心，通常是由几个活性功能基组成。例如牛胰核糖核酸酶的催化中心是肽链序列中第12位和第119位的两个组氨酸。C.G.奥弗贝格等根据胰凝乳蛋白酶的催化中心与丝氨酸的羟基、组氨酸的咪唑基和天冬氨酸的羧基有关的事实，用乙烯基苯酚与乙烯基咪唑进行共聚合，制得带有羟基和咪唑基的-胰凝乳蛋白酶模型,用这个模型聚合物作为3-乙酰氧基－N－三甲基碘化苯胺,水解的催化剂，当pH为9.1时,其活性比单一的乙烯基咪唑高63倍。3.模拟酶与底物的作用酶分子具有一定的空间构型，它与被催化的底物的作用在构型上有较严格的匹配关系，体现了酶的专一性。为了模拟酶的结合功能，近年来人们合成了许多冠醚化合物来模拟酶。随着冠醚空穴尺寸的不同，其对底物的选择性也不一样。4.模拟酶的性状在水溶液中，酶形成巨大的分子缔合体（胶束），构成同一分子内的疏水和亲水微环境。模拟酶的这种微环境中的化学反应的特殊性质，也是模拟酶的一个重要方面。有人利用组氨酸的衍生物十四酰组氨酸与十六酰烷基－三甲基溴化铵组成两种分子的混合微胶束，来催化乙酸对硝基苯酯的水解，其速率比组氨酸增加了100倍。5.模拟酶的高分子作用方式酶是一类由氨基酸组成，以多肽链为骨架的生物大分子。人们利用高分子化合物作为模型化合物的骨架，引入活性功能基来模拟酶的高分子作用方式。例如，用分子量为40000～60000的聚亚乙基亚胺作为模型化合物的骨架，引入10％摩尔的十二烷基和15％摩尔的咪唑基，合成一个硫酸酯酶模型.用这个模型聚合物催化苯酚硫酸酯类化合物的水解，其活性比天然的Ⅱ型芳基硫酸酯酶高100倍。10.1.2抗体酶（Abzyme)内容抗体酶概念抗体酶产生的理论基础抗体酶的制备方法抗体酶的应用抗体由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球蛋白。抗体的最显著的特征是多样性和专一性抗体中的每条链中有恒定区和可变区。相同点：都是蛋白质，都有特异性。不同点：1）酶与抗体的差别：酶是能与反应过渡态选择结合的催化性物质，抗体是和基态分子结合的催化性物质。2）酶的活性和合成受到代谢调节，种类有限。抗体只有在抗原存在时才产生，种类无限。抗体与酶的异同：酶是生物催化剂酶是一类具有催化功能的生物分子酶反应有两个主要的特征：高催化效率、高选择性1946年，Pauling用过渡态理论阐明酶催化的实质酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。对任何化学反应，反应物在变为产物之前，必须获得一定的能量，成为活化态或称过渡态。过渡态处于最高能阶上。过渡态与反应物的能阶之差称为活化能。获得活化能的多少与反应的速度成正比。过渡态理论是解释酶催化原理的经典理论。过渡态理论过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应所需的活化能。过渡态理论与反应过渡状态结合作用在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成复合物的实际上是底物形成的过渡状态，酶与过渡状态的亲和力要大于酶与底物或产物的亲和力。1969年Jencks根据抗体结合抗原的高度特异性，与天然酶结合底物的高度专一性相类似的特性，在过渡态理论的基础上首先提出设想：能与化学反应中过渡态结合的抗体，可能具有酶的活性，催化反应的进行。1986年Lerner和Schultz证实了这一设想。抗体酶设想抗体酶的发现Lerner和Schultz分别领导各自的研究小组首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。1986年美国Lerner和Schultz两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为催化抗体，即抗体酶。1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应的羧酸二酯的过渡态类似物。诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。抗体酶抗体酶（Abzyme）或催化抗体（Catalyticantibody)是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。抗体酶具有典型的酶反应特性与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过天然酶的专一性；具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快102～106倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。过渡态理论与抗体酶如果使抗原最大限度地接近某一特定反应的过渡态，就可能使诱导的抗体在与之结合时发挥催化作用。实际所采用的过渡态抗原知识推测而设计的过渡态类似物。用过渡态类似物诱导的抗体所催化的反应并非该类似物本身，而是与其相似的另一种反应。抗体酶的特性1、能催化一些天然酶不能催化的反应有许多化学反应还没有已知酶催化进行抗体的多样性决定了抗体酶催化反应类型多样性抗体酶可以根据需要人工裁制一种对酶促反应过渡态特异的抗体结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。抗体酶的催化反应类型1、转酰基反应2、水解反应3、Claisen重排反应4、酰胺合成反应5Diels-Alder反应6、转酯反应7、光诱导反应8、氧化还原反应9、脱羧反应10、顺反异构化反应抗体酶的特性2、有更强的专一性和稳定性抗体的精细识别使其能结合几乎任何天然的或合成的分子抗体酶催化反应的介质效应酯解反应中介质效应：抗体酶在有机溶剂中具稳定性。脱羧反应中介质效应：有机溶剂引起脱羧反应速率增加。酰基转移反应中介质效应：在疏水溶剂中，活性较高。抗体酶的制备将抗体转变为酶可通过诱导法、拷贝法、引入法、化学修饰法等途径。诱导法是利用反应过渡态类似物为半抗原制作单克隆抗体，筛选出具高催化活性的单抗即抗体酶。拷贝法主要根据抗体生成过程中抗原-抗体互补性来设计的。引入法则借助基因工程和蛋白质工程将催化基因引入到特异抗体的抗原结合位点上，使其获得催化功能。化学修饰法对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。1.诱导法用设计好的半抗原，通过与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞则分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得抗体酶。用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。2.拷贝法3.引入法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术四、抗体酶的应用1.戒毒:用可卡因水解的过渡态类似物-磷酸单酯为半抗原，产生的单克隆抗体能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片断失去可卡因刺激功能。2.肿瘤治疗抗体介导前药治疗技术:将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，则酶通过和肿瘤结合的抗体存在于细胞的表面。静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物。第二节核酶（Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的种类三、核酶的应用四、核酶面临的问题五、影响核酶活性的因素具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶enzyme极端酶extremozyme抗体酶abzyme生物工程酶其它：模拟酶核酸类:克隆酶遗传修饰酶蛋白质工程新酶、RibozymeDeoxyribozymeI型内含子剪接型核酶II型内含子锤头核酶剪切型核酶发夹核酶自体催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP异体催化二、核酶的分类1.剪接型核酶剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子（Intron)。1）I类内含子的自我剪接(Self-splicing)I型IVS(interveningsquense,间隔序列）是与四膜虫26srRNA前体的IVS结构相似的间隔序列，具有环状结构。通过转磷酸酯反应，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS经两次环化生成L-19IVS。催化过程需要鸟苷酸或鸟苷以及镁离子参与。剪接机制L-19IVS在体外的多种酶活性p3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HOⅠ类内含子的剪接机制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外显子内含子或居间序列（Interveningsequence,IVS)5‘UpAGpU5'3'5'外显子3'外显子内含子pG-OHpGpAGpU3'U5'OH第一次转酯反应第二次转酯反应U5'pU3'pGpAGOH5'3'UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCUAAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜虫rRNA前体自我剪接反应1、转核苷酸作用2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、转磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCp