层析介质

GEHealthcare22GEHealthcare1/17/2020如何选择凝胶？•五大类层析方法-1.凝胶过滤(GC)2.离子交换(IEX)3.亲和层析(AC)4.疏水层析(HIC)5.反相层析(RPC)•介质-颗粒越细、大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较高(SOURCE介质例外)•物理稳定性-新一代介质较坚固，能承受高流速，同时保持柱床体积和结构稳定，省却每次重新装柱，提高重复性•化学稳定性-新一代介质能承受极端pH，高盐度，促溶剂和有机溶剂，利于开发分离条件和在位清洗(CIP)，大大延长介质寿命和提高重复性33GEHealthcare1/17/2020BioProcess凝胶特别适合生产应用,特点包括：•高重复性：适用于任何规模的工艺放大•高物理、化学稳定性：易于清洗、消毒及再生、介质寿命特长•高动力载量、流速快：缩短生产周期和次数，节省凝胶用量(尤其XL介质，载量可比普通介质高达10倍！)•每种凝胶均有完整的文献、档案和RegulatorySupportFile44GEHealthcare1/17/2020用空柱子须留意•使用调节器(flowadaptor)-保护柱床的同时更可提高分辨率，节省凝胶•柱子物料须生物兼容，并有尤良的化学抗性•加上装柱器(packingreservoir)，可一步把凝胶装满柱子，大大提高柱效，尤其是凝胶过滤柱•柱子的过滤网孔径应该是凝胶颗粒的1/3,一般10um孔径就够用，如用SOURCE15介质装HR柱和XK柱，须换上5um的网•XK柱完全配合AKTA及各种自装的凝胶，是最佳的选择55GEHealthcare1/17/2020线性流速对体积不同的柱子来说，体积流速不能直接用作比较，一般都换算成线性流速，再作比较：体积流速(ml/min)x60线性流速(cm/hr)=----------------------------------------柱子横切面积(cm2)线性流速(cm/hr)x柱子横切面积(cm2)体积流速(ml/min)=----------------------------------------6066GEHealthcare1/17/2020装柱检测检测装柱效果一般用0.5%(~30um介质)或2%(~90um介质)柱体积的1%丙酮测柱效和峰形柱效HETP=L/NL:柱床高度N=理论塔板数N/m=5.54X(Ve/W1/2)2*(100/L)每米理论塔板数Ve:保留体积W1/2:半峰高峰宽77GEHealthcare1/17/2020选择层析方法若对目标蛋白或样品不大了解，可尝试以下方法：•用分离范围宽广的凝胶过滤介质如Superose,SephacrylHR依据分子量将样品分成不同组份•用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白，一步即可得到高纯度样品；亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质•体积大的样品，往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯化；高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化•疏水层析用高盐吸附，低盐洗脱的原理，洗脱的样品又可直接上离子交换介质；两种方法常被交替使用88GEHealthcare1/17/2020融合蛋白质非融合蛋白质表达简单纯化一步亲和层析90-97%纯度更高纯度三步纯化策略粗提中度纯化精细纯化多步纯化蛋白质纯化策略99GEHealthcare1/17/2020准备工作考虑:纯度水平需要量保持生物活性有效和经济蛋白质特性:稳定性•-pH•-离子强度•-温度分子量等电点蛋白的疏水性蛋白的特异结合1010GEHealthcare1/17/2020pH的重要性:蛋白质净电荷随pH改变滴定曲线蛋白质净电荷1210稳定性范围用阳离子交换用阴离子交换3pH不同pH下的分离情况21+-1111GEHealthcare1/17/2020pH的重要性:蛋白质净电荷随pH改变流动相的pH选择性VVV阳离子阴离子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面净电荷AbsAbsAbsAbs1212GEHealthcare1/17/2020目的纯化粗样快速浓缩(减少体积)和稳定样品(去除蛋白酶)最适用层析技术:离子交换/疏水层析分辩率快速回收率载量粗提1313GEHealthcare1/17/2020粗提:离子交换填料预装柱20ml颗粒大小流速HiPrep™16/10QXL&SPXL90µm10ml/minHiPrep16/10DEAE&CM90µm10ml/minSepharose™BigBeadsSTREAMLINE™Sepharose™FastFlow1414GEHealthcare1/17/2020粗提:疏水层析填料高载量高流速HiPrep™16/10Phenyl(高&低取代)HiPrep16/10ButylHiPrep16/10OctylHiTrap™HIC选择试剂盒1515GEHealthcare1/17/2020中度纯化目的去除大部分杂质最适用层析技术:离子交换/疏水层析HiLoad™离子交换和疏水层析预装柱分辩率快速回收率载量1616GEHealthcare1/17/2020中度纯化:离子交换填料Sepharose™HP34µmQ&SP150cm/hr小包装和预装柱交联琼脂醣SOURCE™30µmSepharoseHighPerformanceSOURCE30Q&S1800cm/hr聚苯乙烯/二乙烯基苯小包装1717GEHealthcare1/17/2020中度纯化:疏水层析填料Sepharose™HP34µm苯基300cm/hr小包装和预装柱1818GEHealthcare1/17/2020回收率载量目的达到最终纯度(去除聚合物,结构变异物)最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析分辩率速度精细纯化1919GEHealthcare1/17/2020精细纯化:凝胶过滤填料Superdex™30pgSuperdex200pgSuperdex75分离分子量大小(球状蛋白质)102103104105106PrepGrade(34µm)有HiLoad™预装柱和小包装填料Mr100-7000Mr3000-70000Mr10000-6000002020GEHealthcare1/17/2020Superdex-仅需30-40min的凝胶过滤快速重组人生长因子单体和双体分离-~20minSuperdexpeptide:100-7000Superdex30:100-10,000Superdex75:3000-70,000Superdex200:10,000-60,0002121GEHealthcare1/17/2020Mono™BeadsQ&S10µm:MonoQ&S25mg上样载量3µm:MiniQ&SMini™BeadsQ&S2mg上样载量精细纯化:离子交换填料2222GEHealthcare1/17/2020MiniQ和MiniS离子交换柱(3mm)高分辨Sample:dA12-dA30mixtureBufferA:10mMNaOHBufferB:10mMNaOH,2MNaClFlowrate:1.0ml/minMiniQPE4.6/50用少於15min分离12-30碱基的dA寡核酸2323GEHealthcare1/17/2020精细纯化:离子交换和疏水层析填料RESOURCE™15µmQ,SP,Phenyl,Ether,Isopropyl1ml预装柱流速高达10ml/minRESOURCEHICTestKit2424GEHealthcare1/17/2020SOURCE介质：高流速、低反压2525GEHealthcare1/17/2020SOURCE-高速，反压低快速1-2分钟完成分离5mm15mm30mm凝胶过滤离子交换XX亲和层析疏水层析XX反相层析XX2626GEHealthcare1/17/2020精细纯化:反相层析填料Sephasil™µRPCSOURCE™RPC硅胶3µmC2/C18聚苯乙烯/二乙烯基苯120Å:肽类C4,C8,C185and12µm硅胶100Å:肽类300Å:蛋白质pH1-12(14)肽类5,15and30µm2727GEHealthcare1/17/2020SOURCE™30µm15µm5µm离子交换/疏水层析/反相层析反相层析离子交换/反相层析2828GEHealthcare1/17/2020SOURCE5RPCST4.6/150反相柱高分辨疏水性和C18相近兼容从pH1-12分辨率特高选择性更宽可分离一般反相柱分不开的峰5mm15mm30mm凝胶过滤离子交换XX亲和层析疏水层析XX反相层析XX2929GEHealthcare1/17/2020SOURCE5RPCST4.6/150反相柱高分辨3030GEHealthcare1/17/2020层析柱的种类C柱系列简易层析柱，无夹套及flowadaptorXK柱系列标准层析柱Tricorn(HR)柱系列高压层析柱（最大10Mpa）SR柱系列耐有机溶剂层析柱3131GEHealthcare1/17/2020凝胶与层析柱配套XKK9CSRTricronSephadex•••••Sepharose•••••Sephacryl•••Superdex•••Source•(换膜)••3232GEHealthcare1/17/2020层析技术样品起始状态样品结束状态IEX低离子强度高离子强度或pH改变样品体积不受限制样品被浓缩HIC高离子强度低离子强度样品被浓缩AC特异性结合特异性洗脱条件样品体积不受限制样品被浓缩GF样品体积受限制交换缓冲液(5%总柱体积)流速受限制样品被稀释RPC需要有机溶剂在有机溶剂中，或会损失生物活性样品体积不受限制适用于三步纯化策略的层析技术3333GEHealthcare1/17/2020粗样或样品含高盐GF脱盐GF脱盐GF脱盐ACIEXHIC或者需要稀释IEXIEXHICGF或RPCGF或RPCGFGF样品澄清粗提中度纯化精细纯化合理衔接不同层析技术3434GEHealthcare1/17/2020凝胶过滤(GF)•以分子量大小作分离，大分子先走完柱子，小分子后出；不同介质有不同分离范围，须根据目标物的大小而作选择•Superdexpeptide、75、200HR10/30预装柱(颗粒平均大小13um)，有极高的选择性、分辨率和化学稳定性，非特异性吸附低，最高流速可达1-1.5ml/min不等，柱床不会变形，优化条件可在Superdex30、75、200PrepGrade(34mm)上直接放大3535GEHealthcare1/17/2020SuperdexPeptide-纯化小生物分子的新选择•市面上唯一分离范围是100-7000的凝胶过滤介质•选择性和分辨率高，颗粒大小只有13um•高化学稳定性，pH1-14都可工作，有机溶剂亦可，如乙腈+三氟乙酸•结合了Sephadex的高选择性和琼脂糖的高物理稳定性，在高流速下不会变形3636GEHealthcare1/17/2020多肽样品的分析3737GEHealthcare1/17/2020重组蛋白的分析3838GEHealthcare1/17/2020•Sephacryl有6种不同分离范围，提供广阔的选择性，甚至可分DNA质粒和病毒，经济、高效，反压低，易于自行装柱，是Superdex外作下游纯化的理想介质3939GEHealthcare1/17/2020•Superose6,12预装柱(HR10/30,13um)有宽广的分离范围配合高分辨率，优化条件可在Superose6,12PrepGrade(20-40um)直接放大•Sepharose4and6FastFlow是高度偶联的琼脂糖介质，因此大大加强了机械性能，流速特快(200cm/hr)，非特异性吸附极低，适合工业规模生产•Sephadex以渐被以上的BioProcess介质所代替，除了SephadexG-25在工业上用作去盐和交换缓冲液，也有预装了的易用的HiTrapDesalting柱和Fa