搜索
小动物活体成像技术1OpticalinVivoImaging,OI目录一、背景二、原理三、系统组成四、优点目录2五、分类六、应用背景动物模型是现代生物医学研究中重要的实验方法与手段，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生、发展规律，研究防治措施；同时由于大鼠、天竺鼠、小鼠等小动物具有的诸多优势，在生命科学、医学研究及药物开发等多个领域的应用日益增多。1999年，美国哈佛大学Weissleder等人提出了分子影像学（molecularimaging）的概念——应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究。近年来，各种影像技术在动物研究中发挥着越来越重要的作用，涌现出各种小动物成像的专业设备，为科学研究提供了强有力的工具。3背景◆结构成像☞X-Ray☞CT成像☞MRI成像☞超声成像◆功能成像☞fMRI功能核磁共振成像☞PET正电子断层成像☞SPECT单光子发射断层成像◆分子影像☞光学成像☞核磁共振成像☞核素成像医学影像技术的发展背景519—20世纪◆结构成像☞X-Ray☞CT成像☞MRI成像☞超声成像背景620世纪90年代◆功能成像☞fMRI功能核磁共振成像☞PET正电子断层成像☞SPECT单光子发射断层成像背景721世纪以来◆分子影像☞光学成像☞核磁共振成像☞核素成像原理原理—光学成像的原理光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。在偏红光区域，大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用灵敏的活体成像系统最少可以看到皮下的500个细胞，当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系。可见光体内成像技术的基本原理在于光可以穿透实验动物的组织并且可由仪器量化检测到光强度，同时反映出细胞的数量。8原理小动物活体成像系统组成硬件CCD相机、滤光片转轮、透镜、电子学组件、加热的样品平台和冷凝器及相机控制装置组成，这是一种专业的体内成像系统，投光器排成直线，这可以实现快速、可重复的样品放置定位，大小可以随成像视野的变化而变化。软件软件控制IVIS®系统所有装置的设置，提供高级的编目及浏览工具，提供定量分析工具，有好的界面，装置的设置与相机相似，操作简单，两步操作获取图像。麻醉系统2条通路组成，一条是诱导麻醉通路，另外一条是持续麻醉通路。两条通路在氧气和麻醉药异氟烷混合状态下对小动物进行麻醉。系统组成◆能够反映细胞或基因表达的空间和时间分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用。◆由于可以对同一个研究个体进行长时间反复跟踪成像，既可以提高数据的可比性，避免个体差异对试验结果的影响，又不需要杀死模型动物，节省了大笔科研费用。◆尤其在药物开发方面，活体成像更是具有划时代的意义。根据目前的统计结果，由于进入临床研究的药物中大部分因为安全问题而终止，导致了在临床研究中大量的资金浪费，而活体成像技术的问世，为解决这一难题提供了广阔的空间，将使药物在临床前研究中通过利用分子成像的方法，获得更详细的分子或基因水平的数据，这是用传统的方法无法了解的领域，所以活体成像将对新药研究的模式带来历史性变革。其次，在转基因动物、动物基因打靶或制药研究过程中，活体成像能对动物的性状进行跟踪检测，对表型进行直接观测和（定量）分析。优点分类（一）可见光成像★生物发光☞萤火虫荧光素酶：底物是荧光素，光波长在540～600nm☞海肾荧光素酶：底物是腔肠素，所发的光波长在460～540nm。将基因整合到需观察细胞的染色体DNA上，标记后只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光强度与标记细胞的数目呈线性相关。前者所发的光更容易透过组织，在体内的代谢较后者慢，而且特异性好。所以，大部分活体实验使用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因，如果需要双标记或特殊的实验，也可采用后者作为备选方案。☞PpyRed红色漂移荧光素酶：把荧光素酶的发光峰从562nm漂移到612nm。随着发光波长的增加，PpyRed红色漂移荧光素酶穿透性大大提高，被皮肤吸收的比例显著降低，且光的漫射现象减少，提高了活体生物发光成像的灵敏度和分辨率。☞发光酶基因操纵子IuxABCDE或luxCDABE：用于细菌标记，它由控制的编码荧光素酶的基因和编码荧光素酶底物合成酶的基因组成。利用这种办法进行标记的细菌会持续发光，不需要外源性底物。但是，一般细菌标记需要转座子的帮助，把外源基因插入到细菌染色体内稳定表达。通过荧光素酶基因标记的细菌进行胃肠道排空的实验，可以把活体成像的研究应用扩展到药物动力学、胃肠道功能学等领域。分类★荧光荧光成像技术发展迅速，主要表现在成像探针的不断更新，随着小动物成像技术的发展，成像探针种类越来越多，功能越来越强大。☞量子点荧光标记：是纳米技术和体内荧光成像技术结合的一种新技术，除了能对活细胞实时长时间动态荧光观察与成像，对细胞间、细胞内及细胞器间的各种相互作用的原位实时动态示踪外，还可以标记在其他需要研究的物质上，如药物、特定的生物分子等，示踪其活动及作用，在长时间生命活动监测及活体示踪方面具有独特的应用优势。几种基于荧光显微镜技术的方法适用于体外细胞，也适合体内细胞的观察，如多光子显微技术、激光显微共聚焦技术和纤维光学方法等。因为共聚焦显微术使用方便、耗费少，所以应用最广泛，但如果观察时间过长且组织光穿过率低，则光毒性导致的细胞死亡是其应用的局限性之一。分类可见光成像优势：使用低能量、无辐射、对信号检测灵敏度高、实时监测标记的活体生物体内的细胞活动和基因行为，已被广泛应用到监控转基因的表达、基因治疗、感染的进展、肿瘤的生长和转移、移植、毒理学、病毒感染和药学研究中。缺点：二维成像及不能绝对定量。分类（二）核素成像★小动物PET优势：在于特异性、敏感性和能定量示踪标记物，且PET使用的放射性核素多为动物生理活动需要的元素，因此不影响它的生物学功能。放射性标记物进入动物体内后，由于其本身的特点，能够聚集在特定的组织器官或参与组织细胞的代谢；半衰期超短，一般在十几分钟到几小时，适合于快速动态研究。缺点：分辨率虽已达到1mm，但却降低了灵敏度；同时，小动物PET在很大程度上缺少解剖结构信息和使用放射性核素，要求回旋加速器靠近成像设备。★小动物SPECT小SPECT系统使用长半衰期的放射性同位素，不需要回旋加速器。常使用的放射性核素不是生理性元素，它们的半衰期从6h到3d，通常较PET使用的放射性核素半衰期长。可用于监视生理功能、示踪代谢过程和定量受体密度等。分类核素成像核素成像技术用于发现易于为核素标记的既定靶目标底物的存在，或用于追踪小量标记基因药物，进行药物抵抗或病毒载体传送的研究。分类（三）小动物CTCT利用组织密度的不同造成对X射线透过率不同,对机体一定厚度的层面进行扫描,并利用计算机重建三维图像。小动物CT(微型CT)作为一种最新的CT成像技术，具有微米量级的空间分辨率(大于9μm)，并可以提供三维图像；大多数系统使用圆锥形的X射线辐射源和固体探测器。探测器可以围绕动物旋转，允许一次扫描动物整体成像。在小动物骨和肺部组织检查等方面具有独特的优势。但是，对比剂的使用导致射线的危害,因为敏感度和空间分辨率也依赖于CT暴露的时间和对比剂使用的数量。分类（四）小动物MRIMRI依据所释放的能量在物质内部不同结构环境中不同的衰减,绘制出物体内部的结构图像。优点：相对于CT，MRI具有无电离辐射性(放射线)损害、高度的软组织分辨能力，以及无需使用对比剂即可显示血管结构等的独特优点。对于核素和可见光成像，小动物MRI的优势是具有微米级的高分辨率及低毒性；在某些应用中，MRI能同时获得生理、分子和解剖学的信息。缺点：MRI的敏感性较低(微克分子水平)，与核医学成像技术的纳克分子水平相比低几个数量级，所以并非最理想的成像系统。目前，动物MRI发展的焦点集中在新的增强对比因子,以增加敏感度和特异性。分类（五）小动物超声超声基于声波在软组织传播而成像，由于其无辐射、操作简单、图像直观、价格便宜等优势，在临床上广泛应用。在小动物研究中，由于所达到组织深度的限制和成像的质量容易受到骨或软组织中空气的影响而产生假象，所以超声不像其他动物成像技术那样应用广泛，应用主要集中在生理结构易受外界影响的膀胱和血管。应用实例一：可见光之荧光成像Ohyanagi等采用化学与酶合成法联用，合成了N-乙酰氨基乳糖（LacNAc)、唾液酸化N-乙酰氨基乳糖（SialylLacNAc)、路易斯X寡糖抗原（Le）、唾液酸化路易斯X寡糖抗原（SialylLe）等多种功能性寡糖，然后使用配体交换策略合成了上述多种寡糖修饰的量子点。随后他们研究了各种寡糖-量子点缀合物在小鼠体类的代谢情况，发现末端半乳糖结构的glyco-QDs经代谢后主要集中在肝脏；而末端唾液酸结构的glyco-QDs都主要集中在肾脏。应用实例xx应用实例二：核素-SPECT成像孙艳红等采用三齿配体的双功能螯合剂合成β-榄香烯配合物并进行Tc标记，采用SPECT成像仪器观察不同的时间点在荷瘤鼠内的分布滞留情况。成像结果显示，各主要脏器如心、肝、脾、肺、肾、胃肠均有较多分布，注射后1-1.5h小时肿瘤部位浓集明显。结果表明，可以考虑在分子上连接上肿瘤靶向分子，增加肿瘤部位的浓集，提高其抗癌作用的效果。应用实例m99应用实例三：CT成像许天源等利用N-甲基-N-亚硝脲(MNU)诱导构建大鼠原位膀胱癌动物模型，造模成功后，利用大鼠膀胱灌注欧乃派克稀释液后CT平扫的改良CT检测方法对存活大鼠进行活体成瘤鉴定，并通过三维重建进行CTU成像。活体检测后处死所有大鼠，取膀胱组织进行病理组织学观察。所有成瘤大鼠CT扫描均见异常，膀胱肿瘤表现为乳头状，团块状低信号新生物，凸向高信号膀胱腔形成充盈缺损。CTU下，膀胱原位肿瘤表现为椭球表面形状各异的凹陷，大小、边界、位置清晰。应用实例应用图像从左到右依次为：横位CT、冠状位CT、矢状位CT和CTU图像A对照组大鼠B小体积肿瘤大鼠C大体积肿瘤大鼠图中光滑的圆形充盈缺损为膀胱气泡应用实例四：核磁共振成像赵明媛等人采用0.5T低磁场MRI仪对小鼠皮下移植瘤（HepG2、S180、H-ras12V转基因小鼠肝肿瘤组织）和原发性肝肿瘤（H-ras12V转基因肝癌小鼠）进行检测，观察其影像学表现并对H-ras12V转基因小鼠原发性肝肿瘤进行病