经典液相色谱法

1Chap.5经典液相色谱法2本章内容层次掌握：吸附色谱法、分配色谱法的基本原理以及应用，薄层色谱法的基本操作。熟悉：离子交换色谱法的基本原理以及应用。了解：尺寸排阻色谱法、聚酰胺色谱法的基本原理以及应用。3§1吸附色谱法1.基本原理1.1定义一种溶质基于吸附现象而获得分离的液－固色谱分析方法，按操作方式又可分为吸附柱色谱和薄层色谱。41.2吸附色谱法的依据吸附过程的两个规律：1）吸附过程是可逆的，存在着吸附解附的动态平衡,存在一个吸附平衡常数K=Cs/Cm2）吸附剂对不同物质的吸附行为有差异5吸附机理流动相通过固定相时，吸附剂表面的活性中心吸附流动相分子，当组分分子进入柱子时，会赶走流动相分子而占据吸附剂的活性中心位，即组分被吸附；反之，溶剂分子也可把溶质分子赶走，即解吸。61.3吸附等温线指在一定温度下，某一组分在固定相和流动相之间达到平衡时，组分在固定相中的浓度Cs对组分在流动相中的浓度Cm作图得到的曲线，用函数描述为Cs=f（Cm），它描述了组分在两相中浓度之间的关系。7等温线的形状是重要的色谱特性之一。它反映了一定温度下，吸附剂对溶液中某一组分的吸附能力。对某一体系，组分的分布取决于吸附等温线，它有三种类型：线型、凸型和凹型。通常在低浓度时，每种等温线均呈线型，而在高浓度时，等温线则呈凸型或凹型。892.吸附剂2.1对吸附剂的要求1）颗粒要有一定的细度且粒度要均匀2）具有较大的吸附表面积和一定的吸附能力3）与洗脱剂、样品不起化学反应，且不溶于洗脱剂中102.2常用吸附剂无机类：氧化铝、硅胶、硫酸钙、滑石粉、硅藻土等。有机类：活性炭、淀粉、蔗糖等。其中以硅胶和氧化铝较为常用。111）氧化铝优点：分离能力强、活性可控分类：酸性、中性、碱性以中性氧化铝使用较多,用来分离生物碱、挥发油、萜类、甾体、蒽醌以及在酸碱中不稳定的苷类、醌、内酯等化合物。活化温度：200～400℃122）硅胶优点：适用于各类样品的分离吸附能力：取决于骨架表面的硅醇基吸附机理：硅胶表面羟基作为质子给予体，通过氢键形式将溶质吸附在硅胶表面。由于硅胶具有弱酸性，所以选择性地保留胺类和其它碱性化合物。活化温度：105～110℃132.3吸附剂的活性吸附剂的活性与含水量有一定的关系。吸附剂在使用前必须先经过活化处理。活化：在一定温度下，加热除去水分以增强活性的过程。14硅胶含水量(％)活性级别氧化铝含水量(％)0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ15153.色谱条件的选择在吸附色谱中，除了正确选择吸附剂外，还可以通过流动相的选择来改变K值，或改变一对化合物的K值比，从而使它们的K值有最大的差别而达到分离。流动相在色谱分析中除了起着溶质通过色谱柱的作用，还影响着溶质的分配系数，所以在色谱分析中流动相的选择也很重要。极性较大的化合物可以比较强的从溶液中被吸附剂吸附，需要极性较大的洗脱剂才能洗脱下来。16选择色谱分离条件时，必须从吸附剂、被分离物质、流动相三方面综合考虑。174.操作方法—薄层色谱4.1基本概念1）薄层色谱法将吸附剂（或载体）均匀地铺在玻璃板或塑料板、铝箔、聚酯薄膜上，形成薄层，把要分离的样品点加在薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。182）比移值Rf在薄层色谱法中，常用比移值Rf来表示各组分在色谱中的保留行为。Rf(A)=b/cRf(B)=a/c19在给定条件下，Rf值为常数，其值在0～1之间。当Rf值为0时，表示化合物在薄层上不随溶剂的扩散而移动，仍在原点位置；Rf为1时，表示溶质不进入固定相，即表示溶质和溶剂同步移动。Rf值：一般要求0.2～0.8最佳范围0.3～0.5。203）薄层色谱法的特点展开时间短，一般只需十几到几十分钟；分离能力强，斑点集中；灵敏度高，通常用量为几至几十微克；显色方便；仪器简单，操作方便。214.2操作技术薄层色谱法的操作步骤：选择—制板—点样—展开—斑点的检出—定性定量221）选择(1)选板—玻璃板表面光滑、平整清洁(2)固定相：吸附剂；粘合剂(3)流动相(4)显色剂232）制板薄层板的制备，就是将吸附剂均匀地涂铺在玻璃板上，使成薄层称之为制板。制板的步骤：(1)吸附剂的涂布(2)板的活化24(1)吸附剂的涂布常用薄板：加粘合剂的硬板和不加粘合剂的软板一般氧化铝采用软板多，而硅胶常采用硬板。硬板的涂铺方法：倾注法、平铺法、涂铺器、喷雾法25(2)板的活化铺成的薄层，必需置于水平台面上晾干（也可以热风吹干），再置烘箱中活化即可。263）点样薄层分析时，一般使用微量注射器或毛细管点样。注意事项：（1）溶剂应易挥发或用流动相。（2）样品浓度合适，一般对照品浓度宜控制在几mg/ml。27（3）点样体积宜在20ml以下，点加量一般为几~几十微克，直径以小于3mm为宜。少量多次点加。（4）点样时，原点距离底边、两侧边以及点与点之间的距离均应在1~1.5cm。（5）要求原点直径一致，点样间距精确。所有原点应在同一水平线上，斑点面积也尽可能一致。28（6）用于定量或分离提纯时，往往沿着起始线点加样品成一条状，以使点加的量相应增多。（7）点样时最好在密闭容器中或比较干燥的条件下完成，避免薄板吸收水分降低活性，若在空气中点样，时间最好在10分钟内完成。点样完毕后使溶剂挥干，再选用适当溶剂展开。294）展开（1）展开原理将薄板一端浸入展开剂，点样处不可接触展开剂，展开剂借助毛细作用上升，带动样品中组分的迁移。30（2）展开箱的分类常规饱和箱（NS）用溶剂饱和的滤纸作衬里使展开箱充分饱和（CS）夹心板箱，可减少展开箱的体积（3）展开剂的选择首选单元溶剂，再选混合溶剂（由简至繁）31（4）边缘效应①定义：点于同一薄层的同一物质的斑点，在色谱展开过程中，靠薄层边缘处斑点的Rf值与中心区域斑点的Rf值有所不同，此种现象称为边缘效应。②产生原因：边缘效应多数出现在极性强弱不等的混合溶剂展开系统中，用单一组分展开剂，边缘效应较为少见。32③减少边缘效应的办法最好用较小体积的展开缸或将薄层在缸内放置一定时间，待溶剂蒸汽达到饱和后再展开；如在展开缸内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条，效果也很好；如采用3cm以下的狭小薄板，只点2～3个点时，也会减小边缘效应。335）斑点的检出（1）光学检出法（2）显色剂法显色剂种类：专属型显色剂、通用型显色剂346）定性与定量分析定性分析（1）用保留值定性－Rf（2）用多种溶剂系统定性定量分析（1）斑点捕集后洗脱测定法（2）薄层扫描法35影响Rf值的因素：分离对象的化学结构、固定相的组成及性质、流动相的组成及性质、介质的影响（包括实验室及展开箱的湿度、温度、饱和与否、上样量等等）解决方法：为了解决由于Rf值重现性差，进行定性困难的问题，也可以采用相对比移植Rst来定性。Rst＝Rf(i)/Rf(s)36薄层扫描法定义：直接测量板上被分离化合物斑点的吸收、反射、荧光等进行定量的方法。分类：吸收扫描法和荧光扫描法扫描方式：线性扫描法和锯齿扫描法定量方法：外标法—外标一点法和外标两点法内标法37优点：快速、高效、灵敏主要不同：吸附剂颗粒小薄层厚度薄点样直径小展开方式不同高效薄层色谱38§2分配色谱法分配色谱是将某种溶剂涂布在固体颗粒表面或纸纤维上形成一层液膜作为固定相，利用各组分在固定相和流动相之间分配系数的不同而实现分离的方法。391.基本原理msCCK分配定律：分配色谱以直线型等温线最普遍，洗脱峰峰形对称而尖锐。在分配色谱中，用溶剂极性来描述分配作用的，因此溶解度的“相似相溶”经验规则可用于分配色谱中。402.分配色谱的分类正相色谱：固定相的极性大于流动相的极性保留：极性越大的组分保留越强反相色谱：流动相的极性大于固定相的极性保留：极性越小的组分保留越强413.载体作用：负载固定液要求：化学惰性，粒度小而均匀，纯净，与固定液间有较大的分子间作用力。常用载体：硅胶、硅藻土、纤维素424.固定液相与流动液相溶剂对选择原则1）不相互溶（预先互饱和）2）SsSm(提高分析效率)43固定相与流动相的选择先采用对各组分溶解度均较大的溶剂为洗脱剂根据分离情况改变洗脱剂的组成和比例（即在流动相中加入一些别的溶剂），调整各组分的分离及洗脱速率445.操作方法5.1柱色谱固定相的涂布与装柱分配柱色谱的加样和洗脱5.2纸色谱色谱纸的选择和处理点样及展开分离混合物，Rf值之差最好大于0.05以免斑点重叠；鉴别单一化合物，Rf值最好在0.4～0.6之间。456.应用分配色谱适用于各种类型化合物的分离，尤其适用于是强极性亲水性物质的分离（如：脂肪酸和多元醇）优点：较好的重现性，并可根据K值预示分离结果。分配系数在较大的浓度范围内是常数，其洗脱峰多数为对称峰，峰形尖锐。在大多数情况下，均能找到一组合适的溶剂进行分离。46吸附色谱法:亲脂性物质分配色谱法:亲水性物质47§3离子交换色谱法以离子交换树脂为固定相，用水或与水混合的溶剂作为流动相，利用离子交换树脂对各组分离子交换能力（亲合力）的不同而使实现分离的方法称为离子交换色谱法(ionexchangechromatography,IEC)。481.离子交换树脂的分类离子交换树脂主要由高分子聚合物的骨架和活性基团所组成，它的骨架具有特殊的网状结构。以聚苯乙烯型最常用。根据所交换离子的电荷可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。491.1阳离子交换树脂根据可交换的离子的不同氢型树脂－－含有－SO3H,－COOH,－OH,－SH,－PO3H2等酸性基团盐型树脂－－含有钠盐、钾盐依据其酸性强度强酸型阳离子交换剂弱酸型阳离子交换剂树脂的酸性强度一般按下列次序递减：R－SO3H＞HO-R-SO3H＞R－PO3H2＞R－COOH＞R－OH50磺化苯乙烯树脂由苯乙烯和二乙烯苯经聚合，磺化而成，是应用最普遍的离子交换树脂CHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHCHCH2CHCH2CHCH2CHCH2CHSO3HSO3HSO3HSO3HSO3HSO3HSO3HSO3HSO3H51交换反应：R-SO3-H++Na++Cl-R-SO3-Na++H++Cl-521.2阴离子交换树脂根据可交换的离子的不同氢氧型树脂－－N+R3OH-氯型树脂－－N+R3Cl-依据其碱性强度强碱性阴离子交换树脂弱碱性阴离子交换树脂532.离子交换树脂的特性2.1交联度定义：表示离子交换树脂中交联剂的含量，通常以重量百分比来表示。高交联度树脂－网状结构紧密，网眼小，刚性较强，能承受一定的压力；孔穴较多；溶胀较小，吸水量少。低交联度树脂－网状结构疏松，网眼大，具有较好的渗透性，但存在着易变形和耐压差等缺点。54根据分离对象选择树脂交联度：分离小分子物质（氨基酸）——选择8%树脂为宜分离分子量较大的物质（多肽）——选择2－4%树脂为宜552.2交换容量定义——是指每克干树脂中真正参加交换反应的基团数。常用单位为mmol/g。交换容量是一个重要的实验参数，通常以实测值为准。562.3溶胀定义——当将树脂浸入水中后，有大量水进入树脂内部，引起树脂膨胀的现象称为溶胀。溶胀的程度取决于交联度的高低——交联度高，溶胀小；交联度低，溶胀大。一般说来，lg树脂最大吸水量为lg。572.4粒度离子交换树脂的颗粒大小，一般是以溶胀状态所能通过的筛孔来表示。实际操作根据需要选用不同粒度的树脂：交换纯水常用10－50目树脂，分析用树脂常用100－200目。583.离子交换平衡离子交换反应可用下式表示：R-A++B+R-B++A+59离子交换反应平衡时：选择性系数（交换系数）〔R-A+〕〔R-B+〕分别表示在树脂相中A+、B+的离子浓度〔A+〕、〔B+〕分别表示A+、B+离子在溶液中的浓度。]][BA[R]A][R[K-B/AB60当各离子强度和树脂的填充状况一定时，KA/B为常数。KA/B＞1，说明树脂对B比对A有更大的亲合力离子的相对亲合力将随水合离子半径的增加和电荷的减小而降低。61离子交换色谱的分离机理利用样品组分选择性系数的