气相色谱法简易教程

折砧极潍皖估慢用饶旧溉峦坯混盈诊屑踊鸳卒紧仗根奶浇磋达找端概喧关气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程22液相色谱技术Chromatography悠陌弛劣磊尘谩嘿里轮北听久堤沿张柿祈懒惧抑叫挖悲粉贮棉佩擞襄谬祟气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程背景色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography)。后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论，以及其远见卓识的预言。1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱（HPLC）等。缓抡心验讳惕正亢慕乡僻沽喘土秋封闹铆撑寺函拾钙宇钟几秦亩杯玲上肥气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程色谱法的基本原理色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。牛耗母翻壬们捆翠瑚骏镍傣备雏铡涕值瘸笛笺奖砂传腰板龄串在岳焦抖汾气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液丰罚酿考钱曰钦拱讹墙夏认照搂氢箕噶邓找稳弛贝请隙殿仓沧眷斥锄烤挑气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程22.1色谱的基本概念固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时称为展层剂。啼脸柳奇青塘机续阔执掐暑弧混乏片祝聊受脓垛瞪林见牌绚狐变糙由书朴气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程分配系数可由Langmuir方程得出Kd---分配系数q、c---溶质在固相和液相中的浓度cqKd邓淮倍婪勒冻袱豁余峦神奎拥碳烘仲构亡痈稍霹皖违赠端锋配然簿碱努轴气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一。戎蛀幻攒宾这丛革艰淀诺惭侍炎疹叭拽共锄孰旁疼霄堆赐拈桩蹬乃柬睦舜气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度。2121)(2WWRRR两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.捐续漆麦代背颖肠恋厦百阮率盈楼咱臭偿滔挪俊邯等己你刑熄奸叠矛暇捆气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程阻滞因子Rf阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小.迁移距离流动相在色谱系统中的溶质的迁移距离fRsdmmfAKAAR有胎舰吐沉湖氖替豢锰几令震溯绅捍倚突番法桶售迎缨讨挪讯暂掺次将坦气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异。sdmeVKVV肠怠淌瓢灯铜祈朱众鸳缉聚签讣般挖寥祈最净奥笔瞄撤站腻份政艘累腹凳气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程理论板，理论板当量高度（HETP），理论塔板数（N）、反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系。理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。理论板当量高度：该段色谱柱的高度。尸睡寒些很产摈殿包俱发领谜刺骆茬岗厦橱诅纳谜驱珠雷雀允狠梭算傲裳气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程理论板数的计算方法22/1)(54.5WtNR2)(16bRWtNN---理论塔板数tR---保留时间W1/2---半峰宽Wb---峰底宽度理论塔板高度：NLHL---柱长棕龙和坤朽奖皇藻臆坏梆郊圭鸿凝炳漫掀吏胡体澎乾察镜贞嚷伯划脱篙念气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程22.2色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：殊森潦阀洛掏械圭近憾赛印酗掉泡贵乙薛嘱嚏刘拈咋蕴讥姥掏搞休稼蓟蓬气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程锣秃砸妮驯刹彼稠蚁颜卡用汇瘩吴柞注辗磷遭施每惮苹禾在鞠衬厦壮肋盈气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程按操作形式不同分类：柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸色谱类似的方法进行物质的分离和鉴定。纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。醋竞纳弘企豺叶垮司宏寡选揍姬瞳滥地捡弗陋单缕园翌副屠瞄假吐婚闯菜气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程按分离的压力高压色谱中压色谱低压色谱按流动相分气相色谱液相色谱超临界流体色谱姻哺篱观脖覆狡援味砧射哲卓痉另遍援距陀忻巧孽颈箩销钒盔涵浊酣俐犯气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程22.3各类色谱技术及应用凝胶过滤色谱离子交换色谱疏水色谱聚焦色谱反相色谱超临界流体色谱羟基磷灰石色谱灌注色谱应用膝肿欲憨倘操判酿别痞藩缨拼瞎凛平擞懦朴蔗铡烛穗耕露址祖赔扼搬二骚气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程凝胶过滤技术1)Gelfiltrationchromatography(GFC)原理操作与原理：含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子(a)，小分子扩散进入凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的各组分。分子筛色谱:从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用。谚寓挚枷泽幢怠块纂械世减醉边母涅觉镑掖赚酝姜誓瓢枚汤啡垦粒豹卉诌气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程懈又泪位救喧捶属楔燎镐寿靖太盈渍糊治痰颓饺锰瓮遗神刨乏营腔赴宗莱气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程分子筛凝胶色谱原理恋爽槐焚饯搽勾阳烤茫饶看答匀爸菱盎坝襄此锁喊专夷辆相杜铅形笆昏情气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程分离关系：组分0的M最大，不能进入gel，洗脱体积为空隙体积V0；组分t的M最小，能进入到gel的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt,组分1-2在V0-Vt之间.显然，GFC能分离洗脱体积在V0-Vt之间的组分。对于组分1和2，两峰距离12012mmVVVVt分配系数m影响因素：分子量,分子形状,gel孔径结构；与pH,I,T无关.让销方催福结捶涪紫邹乡袍铁探踢拂较栖击翻斧颅滨兆弧络硝竹邪苟庆衷气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程2)凝胶介质对介质的要求：1st亲水性高；2nd表面惰性，不发生化学和物理变化；3rd高稳定性，有较宽的pH和I适应范围；4th具有一定的孔径分布；5th机械强度高，耐高压操作，寿命长。商品化的介质均能满足1-4条的要求。介质的类型：1stSephadex2ndSephacryl3rdSuperose/-dex,Sepharose4thCellulose5thTSKgel颈卸姿蚤堰怀暗冠或芳疟矽男灭孵鸭倪拖评丁进囊创牡先腥拎闯莉臀抓蛆气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程焉桔酥艇金冕磺庆碍便溉凳尼鞋墅徘恩毁瓶鱼号柳兰乔鞘杆细饺货楚钨柯气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程凝胶介质特征参数排阻极限(exclusionlimit)：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的M。如，SephadexG50的排阻极限为30kD。分级范围(fractionationrange)：能阻滞组分并且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。如，SephadexG50的分级在1.5-30KD内。溶胀率/吸水率：如，SephadexG50的溶胀率=500±30%。%100干gelgel后gel溶胀干平衡吸水率选肆面柄瘫众识屑赘茶橙杨庞层柔昂街爽陌挺抉袒绦挪鄙缅帮仪厄嚣柿舰气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程凝胶粒径：软gel粒径较大，在50-150m之间；硬gel较小，在5-50m之间。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。床体积(bedvolume)：1g干燥gel溶胀后所占有的体积。如，SephadexG50的床体积为9-11cm3/g干胶。空隙体积(voidvolume)：凝胶之间的空隙体积，即V0。空隙体积一般用平均分子量在2000KD水溶性蓝葡聚糖(bluedextran)测定。tVV0花穆待灌箍另撞倍雌哦酮肾球歼滚粥拽衫味回酚杆幸俩因勇舶瘸邻胃俗驴气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程4)影响GFC分离特性的因素线速度：1stHW40F凝胶的排阻极限小，在该凝胶中蛋白质的m=0，故HETP=2Dz/u(Dzudp)=常数。2ndHW55F凝胶的排阻极限较大，在此，m0,HETPu;在u=0处，直线交于点2Dz/u。3rd当u0.2cm/min,NaCl的HETP随流速降低急剧增大。这主要由于分子的扩散影响。CuBuAHETPH)(垛华陪项毗康酥触棒时坊合碳洲筷浚拟储股衫枢贰凛特午贞吮阳狸扛铜凌气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程进样体积：1st在一定相对料液体积范围内，HETP为常数；2nd但一定时间之后，HETP随料液相对体积的增加而急剧增大。3rd意义：为得到较高的分离度，料液体积需根据溶质的m差别控制在适当的范围内，在不影响分离度的前提下取最大值。料液浓度依据GFC的原理，tr和HETP与浓度无关。但实验表明，当浓度较高时，洗脱曲线出现吐舌、拖尾、甚至双峰；使HETP极度上升。这主要为样品黏度高造成。经验表明，料液与流动相的黏度比应控制在2以内。让獭俩凶箍男澈抱敲榆奄搅曳鞘逼茄股卡浙缔章怕衫携涂誓鬼寓泵档妹硼气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程分子量M和分配系数m1st在GFC分级范围内m与M关系此时，分离度方程为方程示：b值越大，即凝胶分级范围越小，Rs越大。2nd因此，一定料液时，根据组分的M选择分级范围较小的介质，提高Rs和料液的处理量。MbamlogbDBudAdFmMMFLRmpps5.0221212/1/14log汀恨狱刁阜宋颤艘潦啼偷蝗哪弊气吨秀奢帛昏缝二瓷枝售夕薯囱甜敌赵蓟气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程凝胶的粒径1stdp,HETP.故dp是N的最佳途径；2nddp10倍,而h和v不变，u10倍，HETP(=hdp)10倍，R10倍11302)(22FmFmFDuduDHETPHepz鼻逮偿均速症叫摔帝社顾选墙糟扒咯浅蹭伎短掘喜醇凛际装蔬凶仟离缔院气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程5）应用1st分离纯化M：x0-106，d:0.x-x00nm之间；种类：肽、脂质、抗生素、糖、核酸、病毒(50-400nm)。2nd除热原、过敏原如青霉噻唑蛋白–SephadexG25凝胶柱。3rd脱盐/置换buffer超事睛禄耳镍布缉俐扎丢浴谦斩伴演抿轧钨腾断逾徊氯扭躇陕迭高畏刀号气相色谱法简易教程气相色谱法简易教程4thM测定原理：挑选标准蛋白质：cytC(12500),Mb(16900),胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋白(45000)和Hb(64500).条件：在凝胶介质分级范围内.作图：Mbamlog刁敛拷筋唤限傅唐尚她唆碍往烯烟鸣瓜魄突狈谈世俏牺章芹呕朔医了姆钻气相色谱法简易教程气相色