从生物样品中分离纯化生物大分子

报告人：王瀚辉陈聪王楠赵一亮指导教师：赵慧珊时间：2014.12概述1.课题研究背景2.课题研究内容及创新点3.课题技术路线4.仪器及试剂5.前期研究基础或预实验结果概述1.课题研究背景2.课题研究内容及创新点3.课题技术路线4.仪器及试剂5.前期研究基础或预实验结果1.课题研究背景生物大分子是指生物体内广泛的活性物质，分子量上千上万甚至更大，多数生物大分子为多聚体。由简单有机化合物聚合而成。20世纪以来，生物化学、分子生物学和细胞生物学生物迅猛发展，实验室里生物大分子的合成进步速度可观。大分子的分离纯化与鉴定一直以来是生物化学研究的基础，是生物化学工作者的重要基本功。生物大分子广泛存在于机体的各类组织中，以蛋白质、核酸、脂质、多糖为主。诸多生物大分子合成分离和纯化已经从实验室走向工厂化，因此生物大分子的相关技术尤为重要。概述1.课题研究背景2.课题研究内容及创新点3.课题技术路线4.仪器及试剂5.前期研究基础或预实验结果2.课题研究内容1.从生物样品中分离纯化生物大分子2.利用分离纯化生物大分子方法从肝组织中提取分离鉴定一种酶（该酶含三个大小不同亚基，pI=6.2。）创新点对该酶的特性结果及分子量不明确，无法利用分子量差异分离，但可以利用其等电点完成分离。鉴定过程中利用SDS-PAGE电泳技术可以鉴定亚基情况是否是符合要求。概述1.课题研究背景2.课题研究内容及创新点3.课题技术路线4.仪器及试剂5.前期研究基础或预实验结果3.课题技术路线(一）从生物样品中分离纯化生物大分子方法1.提取对象选择2.制定提取方案3.文献查阅和前期预备性实验4.生物材料处理5.生物大分子提取方法1.提取对象选择：确定细胞内目标分子的种类，和目标分子的位置。2.制定提取方案：确定一套能够确定完善分离高纯度目标分子的方法。3.文献查阅和前期预备性实验：通过文献资料掌握四种分子理化性质，完善计划，确定分离途径、4.生物材料的处理：生物大分子来源通常为生物组织或微生物菌落，首先需要破碎组织。4.1机械法：1)研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。2)组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。(植物微生物）4.2物理法：1)反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。2)超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。3)压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。4)冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。4.3化学与生物化学方法：1)自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。2)溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。3)酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。4)有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。5.生物大分子提取方法5.1.核酸的分离纯化5.1.1分离纯化原则：（1）保持核酸分子一级结构的完整性意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。具体原则：温度不要过高；控制pH值范围(pH值5-9);保持一定离子强度;减少物理因素对核酸的机械剪切力。（2）防止核酸生物降解DNA酶抑制剂：金属离子螯合剂；阴离子型表面活性剂RNA酶抑制剂：皂土；DEPC(二乙基焦碳酸盐)；肝素；复合硅酸盐；RNase阻抑蛋白；氧钒核糖核苷复合物5.1.2分离纯化的步骤：(1)去除杂质：生物样品内常含有大量多糖，脂质，蛋白质等杂志，利用物理或化学方法将其除去。(2)浓缩：常用沉淀的方法。其好处是：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。(3)测定：一般选用紫外分光光度法或溴乙锭荧光法测定核酸的含量。(4)保存：目标核酸的保存处理5.2脂质的分离纯化(1)先配制氯仿/甲醇=2/1（v/v），取组织按1：20的量和氯仿/甲醇一起组织均浆，分层后在室温下在摇床中摇动15-20分钟。(2)均浆通过滤纸过滤或者离心获得液体。(3)在离心获得的液体中加入0.2倍体积的水或者0.9%的生理盐水，涡旋几秒钟混均，然后2000rpm离心得到两相溶液，如果需要的话用甲醇/水（1/1）的将两相界面洗一到两次，洗的过程不要让甲醇/水与下层混合。(4)通过离心和虹吸去掉上层后，下层氯仿相含有脂质，如果体积在2-3ml以下则通过真空旋转蒸发器或在氮气下浓缩。(5)二氯甲烷可以替代氯仿，结果表明二氯甲烷/甲醇能够取代氯仿/甲醇，因此能够避免氯仿带来的健康、安全和管理问题。5.3糖的分离纯化5.3.1单双糖的分离：常见的单、双糖一般采用合成的方式。制备如下：脱脂→去杂→浓缩→再次去杂→脱色→浓缩→冷却→结晶（→进一步纯化）。5.3.2多糖的分离纯化：脱脂：由于多糖被脂质包围，通常用醇或醚回流脱脂。提取：热水浸提法，微波辅助提取法，超声辅助法，索氏提取法，醇提法，其它方法（如稀碱液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等）除杂：去除混有的蛋白质细胞色素等。纯化：分部沉淀法，盐析法，季铵盐沉淀法，柱层析，制备性区域电泳，膜分离法，金属络合物法，其它方法（如超过滤法、活性炭柱色谱、LKB柱色谱系统等）5.4蛋白质的分离纯化5.4.1前处理：破坏生物样品组织，保证蛋白质不失活下完成。5.4.2粗分级：选用一套适当方法，把蛋白质混合物提取液中，所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。5.4.3细分级：样品进一步提纯5.4.4进一步分离优化：将蛋白精细分离开来。常用有沉淀，离心。电泳。层析。5.4.5浓缩：常用减压蒸馏法，空气流动蒸发蒸馏法，冰冻法，吸收法，超滤法提纯。5.4.6干燥与保存：保证蛋白质活性下将其干燥保存。3.课题技术路线（二）从肝组织中提取一种酶2.1.生物样品的选择2.2生物样品处理2.3.具体检测方法2.4.数据处理2.5.质量控制方法1.生物样品的选择：健康2月龄wistar大鼠原理：由于肝脏内酶常和脂类或者糖结合，故应将实验动物饥饿24h处理。保证肝内酶的活性和减少不必要杂质。2．生物样品处理：2.1大鼠饥饿24h后处死，分离肝脏组织，切碎，匀浆处理，用32层纱布过滤得到匀浆液。2.2蛋白酶活性抑制：用苯甲基磺酰氟（PMSF）抑制蛋白酶活性，防止目标酶水解。原理：细胞内蛋白酶活性较强，PMSF可和蛋白酶结合不破坏蛋白酶结构，防止细胞内蛋白质水解2.3去除核酸：原理：细胞内含有大量核酸，会影响实验结果。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。这里选用链霉素硫酸盐。2.3去除核酸：1%-2%链霉素硫酸盐，沉淀去除核酸。3.1匀浆液的分离：原理：目标酶位置未知，假设存在于基质、线粒体、酶体三个位置，利用差速离心法分离取不同亚细胞组分。3.1匀浆液的分离：3.1.1组分的分离：取匀浆液1.5ml在4℃下12000r/min离心15min，EP管内液面分三层，分别取中、下层。3.1.2亚细胞组分的分离：(1)离心管加0.5ml0.34mol/L蔗糖，下层液体0.5ml轻轻覆盖在上面，1600r/min离心10min,得到上清①。(2)沉淀加1ml0.25mol/L蔗糖混匀，3500r/min离心10min，得到上清②(3)上清①②混合为线粒体及酶体悬浮液。3.1.2亚细胞组分处理：用超声破碎仪破碎处理线粒体及酶体悬浮液。3.2目标酶的初步提取：原理：提取酶的方法有多种，但因为酶的性质未知，故使用能分离酶且不损伤酶活性的盐析法。盐析法：中性盐能破坏蛋白分子的表面电荷使蛋白质聚沉析出。透析法：析出蛋白质因含有大量盐离子影响纯化，故有半透膜透析，离子可以离开半透膜，而蛋白质分子不可以。3.2目标酶的初步提取：3.2.1提取液配置：饱和硫酸铵溶液调节PH值至6.2，将酶溶液与提取液混匀。3.2.2酶的提取：将混合液于离心机3000r/min离心10min，取沉淀物加缓冲溶液溶解，将溶液放入透析袋透析至不再有离子析出。3.3目标酶的分离纯化：原理：DEAE-纤维素为二乙氨乙基纤维素，是阴离子交换剂。其原理基于离子交换层析：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。3.3目标酶的分离纯化：(1)取DEAE-纤维素，调节PH至6.3，进行装柱平衡，用乙酸铵进行第一次洗脱。同时用磺基水杨酸进行检测，收集第二个峰的组分。(2)回收DEAE-纤维素，调节PH至6.1，再次装柱平衡,上(1)取得样品，洗脱，收集第一个峰的组分。3.4目标酶的鉴定：取目标酶提取液，进行SDS-PAGE电泳检测。(1)样品煮沸10-15min(2)制电泳胶(3)上样(4)电泳(5)0.25%考马斯亮蓝R250染色10-15min(6)脱色处理(7)若出现三个条带则确定为目标酶，若无则取线粒体和酶体提取液，如重复3过程。4.数据处理：根据MARKER计算蛋白质相对分子质量。由于蛋白质为三个亚基组成，三个亚基质量和即为蛋白质质量。SDS-PAGE电泳分别得到三个亚基质量，即可得到蛋白质分子量。5.质量控制方法：5.1控制样品分析5.2比对概述1.课题研究背景2.课题研究内容及创新点3.课题技术路线4.仪器及试剂5.前期研究基础或预实验结果4.仪器和试剂试剂：PBS溶液、1%-2%链霉素硫酸盐、苯甲基磺酰氟、饱和硫酸铵溶液、氨水、硫酸、乙酸、蔗糖、磺基水杨酸、DEAE-纤维素、30%PEAG，1.5mol/LTris-HCl(PH8.8),1.9mol/LTris-HCl(PH6.8)，5X电泳缓冲液、100g/L过硫酸铵溶液，四甲基乙二胺，0.25%考马斯亮蓝，脱色液。仪器：试管、超速离心机、常速离心机、透析袋、电磁搅拌器、蠕动泵、玻璃层吸柱、滴管、玻璃板、电泳仪，垂直板电泳槽，烧杯，移液枪，刀片，回形针，塑料盒，刮板，刻度尺。概述1.课题研究背景2.课题研究内容及创新点3.课题技术路线4.仪器及试剂5.前期研究基础或预实验结果5.课题前期研究研究基础：肝脏作为人体代谢反应主要发生的场所，内含多种生物大分子，有较高的研究意义。在已知学习进程中了解和掌握了从生物组织取样方法，蛋白质的离心分离，透析法纯化蛋白，离子交换柱层析法分离蛋白质，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，分光光度法测定蛋白质的含量。以上述知识结合利用可以完成从生物体