第十章 分枝杆菌属、诺卡菌属、放线菌属鉴定

微生物学检验《微生物学检验》国家卫生和计划生育委员会规划教材第十章分枝杆菌属、诺卡菌属、放线菌属鉴定返回总目录本章内容第一节分枝杆菌属12第三节放线菌属3第二节诺卡菌属学习目标及重点学习目标：1.掌握结核分枝杆菌生物学特征，痰涂片抗酸染色及报告。2.熟悉结核菌素试验的临床意义；结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌；星形诺卡菌的鉴别要点，诺卡菌与分枝杆菌、棒状杆菌的鉴别。3.了解结核分枝杆菌的致病物质；麻风分枝杆菌致病性；放线菌属的生物学特性、致病及免疫性本章重点：★结核分枝菌的生物学特性、培养特性★结核分枝菌的微生物学检验★结核分枝菌与其他分枝菌的鉴别第一节分枝杆菌属分枝杆菌属（Mycobacterium）概述•是一类细长弯曲的杆菌，因有分枝生长的趋势而得名主要特点•细长弯曲，分枝状生长•细胞壁含有大量脂质（分枝菌酸）•常用抗酸染色鉴定，呈抗酸染色阳性（红色）•引起疾病多呈慢性，且伴肉芽肿一、结核分枝菌(一)生物学性状1.形态与染色：G+（不易着色），细长略弯，分枝状，有荚膜，抗酸染色阳性。菌体外有荚膜2.培养特性•营养要求较高，最适pH6.5～6.8，在罗氏（Lowenstein-Jensen，L-J）培养基上生长良好•生长缓慢，14～18h分裂1次，在固体培养基上2～5w才出现肉眼可见的菌落•典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样第一节分枝杆菌属结核菌抗酸染色结果结核菌菌落第一节分枝杆菌属一、结核分枝菌３.生化反应•不发酵糖类，触酶试验阳性，而热触酶试验阴性——加热68℃散失活性（区别非结核菌）•烟酸合成试验、硝酸盐还原试验、吡嗪酰胺试验均阳性，可与牛型结核分枝菌鉴别４.抵抗力•对乙醇、湿热、紫外线、抗结核药物（链霉素、异烟肼、利福平等）敏感•对干燥、酸（3%HCl或6%H2SO4)或碱（4%NaOH)、碱性染料（孔雀绿、结晶紫）、青霉素等抗生素等有抵抗力第一节分枝杆菌属一、结核分枝菌５.变异性（１）形态结构变异：结核杆菌的L型：颗粒状（Much颗粒——病灶中革兰阳性非抗酸性）、丝状（２）毒力变异：卡介苗(BCG)：Calmette和Guérin将牛型分枝杆菌经13年230次传代而获得的减毒菌株——活疫苗（３）耐药性变异：耐异烟肼及其他抗结核药物的结核菌株日益增多第一节分枝杆菌属一、结核分枝菌（二）微生物检验1.标本：根据感染部位的不同来采集不同的标本，最常用痰液标本2.标本前处理目前有酸（4%HCl）处理和碱（4%NaOH）处理两种方法3.检验程序第一节分枝杆菌属标本核酸检测接种固体培养基可疑菌落涂片抗酸染色镜检抗体检测慢性生长菌快速生长菌菌种鉴定标本前处理接种液体培养基接种小白鼠豚鼠脏器涂片镜检抗酸染色鉴定试验检验程序第一节分枝杆菌属一、结核分枝菌4.形态学检查（高压灭菌后进行）（1）直接涂片染色镜检（2）浓缩集菌涂片检查法（3）荧光染色：观察形态黄绿色、橙色荧光（4）初步报告：检出抗酸分枝杆菌（结核杆菌？）第一节分枝杆菌属报告方式抗酸染色镜检结果-仔细检查300个视野未发现抗酸杆菌±300个视野内发现1~2条抗酸菌＋100个视野内发现1~9条抗酸菌2＋10个视野内发现1~9条抗酸菌3＋每个视野内发现1~9条抗酸菌4＋每个视野内发现9条以上抗酸菌一、结核分枝菌（5）报告方式第一节分枝杆菌属一、结核分枝菌5.分离培养L-J斜面或平板：生长缓慢，涂片抗酸染色快速培养系统：自动报告6.核酸检测：PCR法第一节分枝杆菌属一、结核分枝菌(三)临床意义1.致病物质：主要与菌体成份有关。（1）脂质分枝菌酸：与抗酸性有关蜡质D:具有佐剂作用硫酸脑苷脂:阻碍吞噬磷脂:促类上皮细胞形成索状因子:与该菌毒力有密切关系第一节分枝杆菌属一、结核分枝菌（2）蛋白质诱发超敏反应（3）糖类抵抗吞噬作用2.所致疾病（1）经多途径感染，引起全身各组织结核病，以肺结核最多见（2）类型原发感染和继发感染3.免疫性抗结核免疫以细胞免疫为主※抗结核免疫属带菌免疫或称传染性免疫※抗结核免疫与Ⅳ型超敏反应同时出现第一节分枝杆菌属一、结核分枝菌4.结核菌素试验（1）原理用结核菌素进行皮肤试验，以检测受试者对结核杆菌是否有细胞免疫及迟发型超敏反应的试验。（2）结核菌素试剂（PPD5单位）旧结核菌素（oldtuberculin，OT)，纯蛋白衍化物(purifiedproteinderivative，PPD)（3）结果48h-72h,根据注射部位是否出现红肿判断结果＜5mm为阴性≥5mm为阳性＞15mm为强阳性第一节分枝杆菌属一、结核分枝菌（4）结核菌素试验意义选择卡介苗接种对象、测定卡介苗接种后的免疫效果了解人群结核菌的自然感染率作为婴幼儿结核病的辅助诊断测定肿瘤患者的细胞免疫功能第一节分枝杆菌属二、麻风分枝菌1.生物学特性•1873年挪威学者ArmauerHansen从麻风患者皮肤结节中发现，又名Hansen杆菌，具抗酸性•细胞内寄生，有麻风杆菌寄生的细胞呈泡沫状，称为麻风细胞•体外人工培养尚未成功•犰狳是动物感染模型第一节分枝杆菌属麻风分枝菌犰狳第一节分枝杆菌属二、麻风分枝菌2.所致疾病:传播途径：主要是密切接触麻风：侵害皮肤、粘膜和神经系统临床分型：（临床表现、病理特征和菌检结果）•瘤型麻风（占20%~30%，传染性强）•结核样型麻风（占60%~70%，传染性弱）•界线类综合症（占5%，可转化为以上两型）3.防治原则：早发现（检验时，标本通常采用刮片），早隔离、早治疗，治疗药物主要有砜类（氨苯砜、苯丙砜、醋氨苯砜）、利福平、氯苯吩嗪及丙硫异烟胺第一节分枝杆菌属麻风“狮面”第一节分枝杆菌属三、非典型分枝菌1.非典型分枝杆菌：除人型结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌与麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌菌群，也称为非结核分枝杆菌2.致病性：多存在于自然界，为条件致病菌3.分类：根据菌落色素和生长速度分为4组•第Ⅰ组（RunyonⅠ群）：光产色菌•第Ⅱ组（RunyonⅡ群）：暗产色菌•第Ⅲ组（RunyonⅢ群）：不产色菌•第Ⅳ组（RunyonⅣ群）：迅速生长菌光产色菌第一节分枝杆菌属4.代表菌种第Ⅰ组（RunyonⅠ群）：光产色菌：堪萨斯分枝杆菌、猿猴分枝杆菌第Ⅱ组（RunyonⅡ群）：暗产色菌：蟾蜍分枝杆菌、苏加分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌第Ⅲ组（RunyonⅢ群）：不产色菌：鸟分枝杆菌复合群(Mlviumcomplex,MAC)、玛尔摩分枝杆菌、溃疡分枝杆菌第Ⅳ组（RunyonⅣ群）：迅速生长菌：龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌返回章内容第一节分枝杆菌属第二节诺卡菌属一、诺卡菌属（一）种类：诺卡菌属（Nocordio）中有22个种，广泛分布于土壤，与医学有关的13个菌种：•脓肿诺卡菌星形诺卡菌•新星诺卡菌非洲诺卡菌•豚鼠耳炎诺卡菌少食诺卡菌•巴西诺卡菌假巴西诺卡菌•短链诺卡菌南非诺卡菌•肉色诺卡菌老兵诺卡菌•皮瘟诺卡菌诺卡菌属主要形成基内菌丝，菌丝纤细，一般无气生菌丝。少数菌产生一薄层气生菌丝，成为孢子丝。基内菌丝和孢子丝均有横隔，断裂后形成不同长度的杆形一、诺卡菌属（二）生物学特性1.专性需氧2.菌体内含分枝菌酸3.分布：土壤中，多数为非致病菌4.常见致病菌：星形诺卡菌（N.asteroides）巴西诺卡菌（N.brasiliensis）豚鼠诺卡菌（N.caviae）5.培养：菌落表面多皱、致密、干燥或湿润，呈黄、黄绿、橙红等色。用接种环一触即碎第二节诺卡菌属（三）星形诺卡菌1.形态：球形、丝状（与以色列放线菌相似，但末端不膨大）革兰染色：阳性抗酸染色：阳性脱色时间延长→阴性(与TB区别)2.类似“硫磺样颗粒”（称色素颗粒）渗出液、痰或脓汁中有时可见淡黄、红色或黑色小颗粒美蓝染色G+丝状，弱抗酸性第二节诺卡菌属（三）星形诺卡菌3.培养：•营养要求：不高（沙氏或普通琼脂培养基）•气体环境：需氧，有气生菌丝•培养温度：室温或37℃•生长速度：缓慢生长，约1w•色素：星形诺卡菌：黄色或深橙色，无白色菌丝巴西诺卡菌：有白色菌丝•菌丝断裂：5d后→链球状或链杆状（放线菌属：24h开始)•培养特征：菌落：有皱褶、颗粒状•液体：菌膜第二节诺卡菌属（三）星形诺卡菌4.鉴定：（1）“硫磺样颗粒”压片（2）取痰、脑脊液、脓汁涂片→革兰染色及抗酸染色（3）分离培养沙保弱或普通琼脂培养基（4）生化试验第二节诺卡菌属（四）巴西诺卡菌•巴西诺卡菌及星形诺卡菌因侵入皮下组织，引起慢性化脓性肉芽肿，表现为皮下肿胀、脓肿及多发性瘘管，如发生于足部或腿部，称足分枝菌病（Mycotoma）。本病也可能由马杜拉放线菌及某些真菌引起•该菌七叶苷、黄嘌呤、肌醇、甘露醇均阳性，可与星形诺卡菌区别返回章内容第二节诺卡菌属第三节放线菌属一、放线菌属1.致病：放线菌能引起牛和人的放线菌病（Actinomycosis）的病原菌，属于内源性感染。因菌落生长呈放射状而得名。2.常见种类：衣氏放线菌(A.israelii)(最多见)牛放线菌(A.bouis)内氏放线菌（A.naeslundii)黏液放线菌(A.viscous)龋齿放线菌（A.adontolyticus)3.培养：厌氧或微需氧•气体环境：5％CO2•培养基：脑心浸液琼脂平板•温度与时间：37℃，24h～48h•菌落:灰白色蜘蛛状、不规则结节状或臼齿状菌落,初次分离时(粗糙)4.生化特性：葡萄糖(＋)甘露醇(＋)吲哚(－)溶血(－)触酶试验(－)(黏液放线菌除外)第三节放线菌属放线菌菌落特点第三节放线菌属5.鉴定（1）形态染色G+、非抗酸性丝状菌（2）培养困难，厌氧或微需氧（3）生化反应不典型（4）硫磺样颗粒（菌落）压片或组织切片，镜下见颗粒呈菊花状硫磺样颗粒(sulfurgranule)第三节放线菌属6.临床意义为正常菌群，如无并发感染一般为慢性无痛性经过（放线菌病）常可引起脓肿和瘘管脓肿或瘘管内容物可检出“硫磺样颗粒”返回章内容第三节放线菌属