西花蓟马的SCAR分子检测技术

西花蓟马的SCAR分子检测技术孟祥钦1，闵亮1,3，万方浩1,2，周忠实1,2，王文凯3，张桂芬1,2,(1.中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100193；2.农业部外来入侵生物预防与控制研究中心，北京100081；3.长江大学农学院，湖北荆州434025)摘要：西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)是一种世界性入侵害虫，寄主范围广，危害严重，2003年首次在我国发生危害，并有进一步扩散蔓延的趋势。针对蓟马类害虫虫体微小、形态相似，难以准确快速区分的问题，采用特征序列扩增区域（SCAR）标记技术，以西花蓟马及与之同域发生的其他种类蓟马为对象，筛选出1对西花蓟马特异性引物（FOMF/FOMR），其扩增片段大小为320bp。种特异性检测结果显示，该对引物只对西花蓟马的基因组DNA具有扩增能力，对同域发生的花蓟马F.intonsa(Trybom)、禾花蓟马F.tenuicornis(Uzel)、烟蓟马ThripstabaciL.等41种蓟马不具有扩增效果。该对引物不仅对不同虫态的西花蓟马具有扩增能力，而且在西花蓟马发生地的寄主植物组织内亦检测到了其卵的存在。同时，该检测技术灵敏度高，对成虫的最低检出阈值为1/160头。本检测技术在口岸检疫以及花卉、蔬菜和种苗调运中的害虫检测和监测中具有重要意义。关键词：西花蓟马；RAPD-PCR；SCAR；快速检测；特异扩增；检出阈值中图分类号:Q966文献标识码:A文章编号:0454-6296(2010)03-0000-00SCARmarkerforrapididentificationofthewesternflowerthrips,Frankliniellaoccidentalis(Pergande)(Thysanoptera:Thripidae)MENGXiang-Qin1,MINLiang1,3,WANFang-Hao1,2,ZHOUZhong-Shi1,2,WANGWen-Kai3,ZHANGGui-Fen1,2,*(1.StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China;2.CenterforManagementofInvasiveAlienSpecies,MinistryofAgriculture,Beijing100081,China;3.AgricultureCollege,YangtzeUniversity,Jingzhou,Hubei434025,China)Abstract:Thewesternflowerthirps,Frankliniellaoccidentalis(Pergande),isaworldwidepest,causingseriousdamagetoawiderangeofhostplants.ItwasfirstreportedinChinain2003,withatrendoffurtherspreading.Mostofthripsspeciesaresmallinsizeandsimilarinmorphology,whichmakesithardtobedistinguishedquickly.Inthepresentresearch,apairofSCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)primers(FOMF/FOMR)whicharespecifictowesternflowerthripswasdevelopedbyusingotherninefamiliarthripsspeciesasthecontrol.ThefragmentamplifiedbytheprimersFOMF/FOMRwas320bpinlength.SpecificitytestsperformedwiththispairofprimersshowedthatallF.occidentalisspecimensweredetectedpositivelyandnocrossreactionswithother41thripsspecies,includingF.intonsa(Trybom),F.tenuicornis(Uzel)andThripstabaciL.,weredetected.Themethodwastestedonasinglemaleandfemaleadult,asinglepre-pupaandpupa,asingle1st-or2nd-instarlarva,andevenasingleegg,andprovedtobeapplicableforthesestagesofF.occidentalis.Moreover,the320bpgenomicDNAfragmentwasclearlyidentifiedinthehostplanttissuescollectedinF.occidentalisinfestedareas.Whenthedilutionwas1/160ofawholefemaleadultofF.occidentalis,基金项目：国家“973”计划项目（2009CB119200）；国家科技支撑计划项目（2006BAD08A14）；公益性行业（农业）科研专项（200803005）；国家自然科学基金项目（30971967）；中央财政国家重点实验室自主研究课题专项经费（SKL2007SR04）作者简介：孟祥钦，男，1983年12月生，河南濮阳人，硕士研究生，研究方向为入侵生物学与分子生态学，E-mail:[e-mail]通讯作者Correspondingauthor,E-mail:[e-mail]收稿日期Received：2009-11-25；接受日期Accepted：2010-01-31the320bpDNAfragmentcouldbeidentifiedforallreplicates.Ourpresentresultsindicatethatthetechniqueisusefulinquarantineatportsandinpestdetectionandmonitoringduringtransportationofflowers,vegetablesandseedlings.Keywords:Frankliniellaoccidentalis;RAPD-PCR;SCARmarker;rapiddetection;specificamplification;detectablethresholdlimitvalue西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)是缨翅目(Thysanoptera)蓟马科(Thripidae)花蓟马属的一种重要害虫，自20世纪40年代即对美国西部的花卉产业造成巨大的危害(Bailey,1940)，近30年来，随着国际贸易活动的日益频繁，西花蓟马迅速传播扩散，已成为世界性入侵害虫(KirkandTerry,2003)。我国于2000年首次在昆明国际花卉节参展的缅甸盆景上截获西花蓟马(蒋小龙等,2001)，2003年在北京温室的辣椒上发现其为害(张友军等,2003)，随后在云南(徐家菊和韦丽莉,2005)、山东(郑长英等,2007)等地亦发现其为害。程俊峰等(2006)采用CLIMEX软件，结合我国634个气象站点的数据，对西花蓟马在我国的潜在适生区进行了预测，结果显示，西花蓟马在我国具有广泛的适生区。即使在非适生区，随着温室、大棚等设施农业的快速发展，西花蓟马的发生也会成为可能。西花蓟马的寄主范围十分广泛，包括菊科、葫芦科、茄科、豆科、十字花科等在内的62科，500多种植物，基本涉及所有的开花植物(Yudinetal.,1986;Moritz,2002)。西花蓟马的为害方式主要有两种：一是以锉吸式口器直接取食为害，降低产量，使花卉丧失观赏价值；此外，成虫将卵产在植物组织中或果实表面影响果实的品质(RobbandParrella,1989;Cockfieldetal.,2007)；二是传播植物病毒，如菊花茎坏死病毒(chrysanthemumstemnecrosisvirus,CSNV)(Bezzaraetal.,1999)、花生环斑病毒(groundnutringspotvirus,GRSV)(Wijkampetal.,1995)、凤仙斑点坏死病毒(impatiensnecroticspotvirus,INSV)(DeAngelisetal.,1993;WijkampandPeters,1993)、烟草条纹病毒(tomatochloroticspotvirus,TCSV)(Wijkampetal.,1995)和番茄斑萎病毒(tomatospottedwiltvirus,TSWV)(Gardeneretal.,1935)等，使病毒病大流行，造成植物严重减产甚至绝收(Jones,2005)。西花蓟马体型微小，成虫体长1.0~1.5mm，并且与其他蓟马种类形态十分相似。而以往常用的形态学特征识别法只能用于成虫的鉴定，对蛹、幼虫和卵则无能为力，对于不完整的蓟马标本，根本无法根据形态学特征进行鉴别，因此寻找快速准确的西花蓟马鉴定技术是有效阻断其进一步扩散蔓延的必要前提。近年来分子生物学技术发展迅速，利用分子标记技术只需要少量的DNA就可以快速准确地鉴定出蓟马种类，该类技术不仅可以检测成虫，对成虫前的各个虫态亦具有同样的检测效能，目前已应用于西花蓟马的鉴定研究(Moritzetal.,2000;Brunneretal.,2002;TodaandKomazaki,2002;游中华等,2007;周力兵等,2007)。特征序列扩增区域(sequencecharacterizedamplifiedregions,SCAR)标记技术是通过随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术筛选出靶标种特异片段，然后将目标RAPD片段进行克隆和测序，并根据此目标片段两端的碱基序列设计特异性引物；然后以该对特异性引物对基因组DNA片段再次进行PCR扩增，进而将与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来；SCAR标记为共显性遗传，待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示(黎裕等,1999)。与通常采用的限制片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、碱基序列测定等方法相比，SCAR标记技术免去了筛选限制性内切酶和碱基序列测定的过程，不仅结果稳定、灵敏度高、重复性能好，而且操作简便、成本低，特异性引物一旦获得，即可用于大规模检测分析。本研究围绕西花蓟马易随蔬菜、花卉及苗木等的调运而传播蔓延，对农业生产造成严重威胁，却难以进行快速准确鉴定的科学问题，采用SCAR标记技术，从检测和监测的角度，研究其快速分子检测技术，并以与西花蓟马同域发生的花蓟马、禾花蓟马等其他蓟马种类为对象进行SCAR标记的种特异性检验，以梯度稀释的单头成虫DNA和不同虫态的DNA为模板进行灵敏性检验，并同时对西花蓟马发生地的寄主植物组织进行了检测分析。该研究结果为西花蓟马快速检测体系的构建提供了依据，为有效阻截西花蓟马在我国的进一步扩散蔓延和危害提供了技术保障。1材料与方法1.1供试虫源西花蓟马种群以市售扁豆饲养于中国农业科学院植物保护研究所南区养虫室，国内发生的其他种类的蓟马均采自田间，具体采集信息如表1所示。其中，西花蓟马由蓟马系统分类学专家LAMound教授(CS