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Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、1.5mlEppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。3）在通风柜中室温处理过夜。4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。2、璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。四、从组织中提取总RNA1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。（液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应，防止RNA酶的降解反应）2)匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。五、从细胞中提取总RNA1)培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。2)悬浮细胞可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。六、操作步骤1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。2、12,000rpm离心5min，弃沉淀。3、按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。（氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相）4、4℃12,000g离心15min。5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。6、按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇（沉淀RNA）混匀，室温放置5-10min。7、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。8、按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇（沉淀RNA），温和振荡离心管，悬浮沉淀。9、4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。10、室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。11、可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。（TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA。用于酶切反应不能使用SDS）12、测O.D值定量RNA浓度。注：此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8之间；产率估计：组织标本：（ugRNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ugRNA/106Cell）：5-15ug。注：组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源；组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。6.1.2.1肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法①使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开，从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织，置于离心管后立即放入液氮中；②组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm离心15min；③取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；④取上清移至新1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置20mins，于4℃，12,000rpm离心15min；⑤弃上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水现配现用），于4℃，12000rpm离心5min，重复此步骤一次；⑥弃上清后，室温干燥5-7mins；⑦加入适量（20-30ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存，检测RNA浓度，并电泳检测。6.1.2.2RNA浓度测定和电泳检测取2ul提取好的RNA溶液，于Nanodrop2000Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度，纯净RNA的A260/A280应在1.8-2.2之间。电泳检测：1%琼脂糖，1×ATE缓冲液，90V电泳30min，凝胶成像系统观察，分析结果。6.1.2.3肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成反应按照TaKaRa公司的PrimeScript®RTreagentKitWithgDNAEraser（PerfectRealTime)反转录试剂盒说明书进行，合成cDNA模板。①（残存的）基因组DNA的除去反应，在PCR管中配置如下缓冲液。试剂用量5×gDNAEraserBuffer2.0μlgDNAEraser1.0μlTotalRNAX*ulRNaseFreedH2Oupto10μl（gDNA、genomicDNA、基因组DNA：是指有机体在单倍体状态下的DNA全部含量，是染色体DNA，与质粒等染色体外DNA区别。）X*：根据检测到的RNA浓度来配置；混合均匀后，室温放置20-30min②反转录反应，在PCR管中配置如下缓冲液（20ulsystem），反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，先按反应数+1的量配制MasterMix，然后再分装到每个反应管中。试剂使用量5×PrimeScript®Buffer2（forRealTime）4.0ulPrimeScript®RTEnzymeMixI1.0μlRTPrimerMix1.0μl①的反应液10.0ulRNaseFreedH2Oupto20μl③混合均匀后，在PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为：37℃15min85℃5sec然后将得到的cDNA存放于-20℃冰箱保存待用。