纸层析

生命科学学院生物化学实验主讲：刘连芬聊城生命科学学院E-Mail：[e-mail]氨基酸的分离鉴定——纸层析法生物化学实验生命科学学院生物化学实验一、实验原理二、主要实验仪器三、实验步骤四、实验小结氨基酸的分离鉴定——纸层析法生命科学学院生物化学实验纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成,滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱,因此在展层时,水是固定相,有机溶剂是流动相。将样品点在滤纸上（原点）,进行展层,样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配,由于它们的分配系数不同,不同氨基酸随流动相移动速率就不同,于是将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用比移（rateofflow,Rf）来表示Rf=原点到层析点中心的距离（X）/原点到溶剂前沿的距离(Y)氨基酸的分离鉴定——纸层析法实验原理生命科学学院生物化学实验只要条件（如溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量）不变，某种物质的Rf值是常数。此时Rf值的大小只取决于物质的结构和性质。可根据Rf作为定性依据。样品中如有多种氨基酸，其中有些氨基酸的Rf值相同或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而达到分离的目的，这种方法叫双向层析。氨基酸的分离鉴定——纸层析法实验原理生命科学学院生物化学实验氨基酸的分离鉴定——纸层析法生命科学学院生物化学实验Exit氨基酸的分离鉴定——纸层析法323216168844161616161212888812121212224488224816124310.750.2536121866.752.252.250.7527920.256.7510.13.40.190.0620.256.7520.26.815.25.4生命科学学院实验药品生物化学实验氨基酸的分离鉴定——纸层析法1.展层剂：正丁醇：水：冰乙酸=20：15：52.平衡溶液3.样品：赖氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，未知混合氨基酸4.显色剂：0.1%茚三酮的正丁醇溶液生命科学学院实验步骤生物化学实验氨基酸的分离鉴定——纸层析法1.准备层析缸，加入平衡溶液，加入展层剂。2.准备滤纸取层析滤纸（16㎝×12㎝）一张。在滤纸12㎝的那条边距边缘1.5㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样点（共4个点样点）。3.点样(4种氨基酸）用毛细管将各氨基酸样品分别点在这4个位置上。每点在纸上扩散的直径最好不超过3mm。生命科学学院实验步骤生物化学实验氨基酸的分离鉴定——纸层析法4.扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1㎝）。待溶剂上升7～8㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，用吹风机吹干。5.显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后用热风吹干即可显出各层析斑点。在脯氨酸的黄色斑点刚好出现时停止吹风。6.计算：计算各种氨基酸的比移（Rf）值。生命科学学院生物化学实验Exit氨基酸的分离鉴定——纸层析法溶剂前沿层析点原点溶剂前沿亮苯丙缬脯赖生命科学学院注意事项生物化学实验Exit氨基酸的分离鉴定——纸层析法1.取滤纸前，要将手洗净，并尽可能少接触滤纸，不得已时只能拿滤纸的一角，平放在洁净的纸上。生命科学学院注意事项生物化学实验Exit氨基酸的分离鉴定——纸层析法2.点样点的直径不能大于0.5㎝，否则分离效果不好，样品用量大会造成“拖尾巴”现象。生命科学学院注意事项生物化学实验Exit氨基酸的分离鉴定——纸层析法3.样品在原点未移动，是因为展层剂出问题，在展层剂中混入了平衡溶剂，因为平衡溶剂是放置时间长了的展层剂，展层剂出现脂化现象，使分配系数发生变化。4.分离时间短使有些已知氨基酸的Rf值非常相似，分析时可以辅颜色不同加以区分。生命科学学院生物化学实验氨基酸的分离鉴定——纸层析法生命科学学院生物化学实验氨基酸的分离鉴定——纸层析法下一个实验酶的专一性及影响酶活性的因素