第2章 基因操作的主要方法和工具-1

第2章基因操作的主要方法和工具－11.分子生物学基本知识1.1基因组（genome）：生物所具有的携带遗传信息的遗传物质的总和,是指生物细胞中所有的DNA，包括所有的基因和基因间区域。人的核基因组：30亿bp（最新资料说28.5亿）2∼2.5万个蛋白编码基因真核生物基因组：核基因组线粒体基因组叶绿体基因组原核生物基因组：染色体质粒病毒基因组：病毒颗粒携带的遗传物质Zeamays（玉米）8,000Homosapiens3,000Oryzasativa（稻）400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana（拟南芥）100Saccharomycescerevisiae12E.coli4.6GenomeSize(Mb)什么是C值？通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量.在真核生物中，C值一般随着生物的进化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。C值悖理（C-valueparadox)：生物的复杂性与基因组的大小并不完全成比例增加细菌真菌等动物阴影部分为一个门内C-值的范围近年来完成的原核生物和真核生物的基因组测序揭示，在一些最基本的生命特征方面，地球上所有生物可分为三大类群，即真细菌(bacteria)，古细菌或古生菌(archaea)和真核生物(eukarya)三界(domain)。1.2生命三界1.3基因组进化的分子基础1.突变系指基因组中小段区域内核苷酸序列的改变。大多数突变是点突变，即核苷酸序列中某一碱基取代了另一碱基，其他的突变则涉及一个或几个核苷酸的插入或缺失。2.重组系指染色体或DNA分子之间的交换与重组,涉及染色体区段或DNA序列之间的新的连锁关系。3.转座转座是基因组进化的一种重要方式，出现在几乎所有生物类型中。其结果是一段DNA或其拷贝从基因组的一个位置转移到另一位置,并在插入位点两侧产生一对很短的正向重复序列。转座子的发现1951年，B.McClintock发现玉米中的Ac-Ds系统。转座子可以分为两大类：DNA-DNA方式转座的转座子：反转录转座子(retrotransposon)：在结构和复制上与反转录病毒类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA，再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座。两端具有反向重复序列转座后靶位点形成正向重复转座子转移已知的转座因子的转座途径有两种：复制转座和非复制转座。复制转座：转座因子在转座期间先复制一份拷贝，而后拷贝转座到新的位置，在原先的位置上仍然保留原来的转座因子。非复制转座：转座因子直接从原来位置上转座插入新的位置，并留在插入位置上，结果是在原来的位置上丢失了转座因子，而在插入位置上增加了转座因子。1.4新基因产生的主要方式：①基因加倍之后的趋异，这类基因基本保持原有的基因功能,但往往获得了新的表达模式,这是新基因产生的主要方式。酵母基因组在1亿年前经历了一次完全的加倍②外显子或结构域洗牌（domainshufflingorexonshuffling):功能域或外显子洗牌由不同基因中编码不同结构域的片段彼此连接形成的全新编码序列。它们有一个全新的结构组合，可为细胞提供完全不同的生物学功能。不同的结构域加倍或重组,产生具有创新功能的基因.真核生物约19％的基因产生于外显子洗牌。③可移动元件的转座和逆转座。④外源基因水平转移。原核生物中DNA的水平转移是一种十分普遍的现象，可通过接合转移、噬菌体转染、外源DNA的摄取等不同途径发生。大多数有关动物种间基因转移主要集中在逆转录病毒及其转座成分。⑤基因裂变(fission)和融合(fusion)，由一个基因分裂成两个不同的基因，或两个或多个基因融合组成一个新的基因，原核生物约0．5％的基因由此产生。⑥非编码序列转变为编码序列。⋯⋯基因之间的同源性：直系同源（ortholog）：不同物种，同一祖先，功能相同。旁系同源（paralog）：同一物种，复制产生，功能可能不同。1.5分子钟单位时间内同源蛋白质氨基酸顺序或DNA核苷酸序列发生改变的比率称为分子钟，通常以百万年发生单个代换为计算单位，可用于估算祖先序列演化的时间，确立系统发生树的进化年代。2.核酸操作2.1核酸的分离和检测DNA,RNA——提取、分离与纯化——重要的第一步(1)核酸的分离、提取通则核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。核酸提取一般包括破碎细胞、酶处理、核酸释放及与其他细胞组分分离、核酸纯化等几个主要步骤。(1.1)破碎细胞机械作用：低渗、超声、微波、冻融裂解和颗粒破碎等。不适于高分子量长链核酸的分离。化学作用：一定pH和变性条件下，细胞破裂，蛋白变性沉淀，核酸→水相。变性条件：加热、表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40等)、强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍等)。pH环境：强碱(NaOH)或缓冲液(TE、STE等)。金属离子螯合剂(EDTA等)螯合Mg2+、Ca2+，抑制核酸酶活性。酶作用：溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)破裂细胞。降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。联合使用：细胞、待分离核酸类型及后续实验目。(1.2)酶处理裂解液中加入蛋白酶（蛋白酶K或链酶蛋白酶），降解蛋白质；灭活核酸酶（DNase和RNase）加入DNase和RNase去除不需要的核酸。(1.3)核酸的分离与纯化高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性。根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法。①酚提取/沉淀法经典方法是酚:氯仿抽提法。裂解细胞；等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1体积)混合液抽提；离心分离；疏水性的蛋白质→有机相，核酸→上层水相。缓冲液饱和酚——蛋白变性；氯仿增加有机相比重，防止酚流入水相；异戊醇可减少操作过程中产生的气泡，下层的界面更清晰。核酸盐经有机溶剂沉淀浓缩含核酸的水相在pH5.0～5.5，终浓度0.2～0.3MNaAc或KAc（钠离子中和核酸磷酸骨架负电荷，在酸性环境中促进核酸疏水复性），加2～2.5倍体积乙醇或异丙醇，沉淀核酸。DNA沉淀用乙醇洗涤，再用水或TE缓冲液溶解。进一步纯化——氯化铯梯度密度离心、透析、凝胶排阻层析②层析法利用待分离核酸与其他组分的物质与理化性质差异建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等。商品试剂盒，分离和纯化同步进行。核酸质量好、产量高、成本低、快速、简便、节省人力以及易于实现自动化。亲和层析法分离mRNA全自动核酸分离纯化系统RocheMagNAPure96MagNAPureLC2.0(2)核酸定量ug（10-6）、ng（10－9）、pg（10－12）紫外吸收法中DNA或RNA的定量A260=1.0相当于:50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸分光光度计BiophotometerThermoScientificNanoDrop2000c(March2,2009)（3）核酸质量鉴定A260/A280DNA纯品:A260/A280=1.8，1.8RNA污染，1.8蛋白污染RNA纯品:A260/A280=2.0电泳28s18s5s（4）核酸的凝胶电泳当前核酸研究中最常用的方法，常用于检测核酸的分子量、纯度、结构变化、序列分析等种类：琼脂糖凝胶电泳（水平电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳（垂直电泳，分辨率可达1bp常用于测序）涌动率决定因素：分子大小，空间构型，电荷数。涌动方向PAGEOC：open－coiledL：lineSC：supercoiled（5）核酸样品的保存DNA：DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；长期保存样品中可加入1滴氯仿。RNA：RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;在RNA溶液中，加1滴0.2mol/LVRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。(6)核酸的检测PCR：常规PCR、RT-PCR、荧光定量PCR杂交：膜杂交（SouthernBlot、NorthenBlot）、组织样品原位杂交核酸杂交SouthernBlot——DNA膜杂交NorthernBlot——RNAWesternBlot——Protein组织切片杂交InsituHybridization——DNA/RNAImmunohistochemistry——Protein主要杂交模式：①核酸的膜杂交原理：核酸变性和复性杂交在膜上进行——核酸印迹杂交分类：DNA印迹杂交（Southernblot）RNA印迹杂交（Northernblot）核酸杂交的基本过程•制备样品•待检测组织样品：动、植物器官、组织，培养细胞，细菌，病毒等•核酸：分离提取DNA（RNA）•酶切：限制性内切酶消化DNA•电泳：凝胶电泳分离酶切DNA混合物DNA变性：获得单链DNA转膜：将核酸样品转移到支持膜上(硝酸纤维素膜、尼龙膜)探针（probe）:互补于靶基因顺序的单链DNA或RNA片段，通常带有标记物如：放射性同位素、荧光化合物或半抗原地高辛等，以检测目的基因。C.杂交D.漂洗、检测×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析SouthernBlot：检测DNA，基因的有无——遗传病、感染性疾病等+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析电泳方向NorthernBlot：检测RNA，基因的表达水平斑点杂交——耗时短菌落原位杂交筛选目地基因②原位杂交应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸进行杂交，再用与标记物相应的检测系统，通过放射自显影、组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位的技术。探针的制备－核酸标记基因组DNA探针：应用最广cDNA探针：不含内含子序列cRNA探针：以cDNA为模板，体外转录获得，单链探针，cRNA－RNA杂交体稳定；RNase敏感人工合成寡核苷酸探针：DNA合成仪合成，不需要纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长——错配，过短——特异性差探针长度：＜500碱基标记物同位素非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素——直接标记、间接标记探针标记方法末端标记法：将标记物导入核算分子的5’端或3’端，适用于合成寡核苷酸探针的标记。末端标记，标记强度低。切口平移法：DnaseI产生切口－DNA聚合酶I加入标记物。标记强度高。引物延伸标记法：模板——核酸分子变性，与引物退火，聚合酶催化延伸反应。用标记的NTP作为底物。所有的核酸序列都有标记，标记强度高。2.2核酸的序列测定加减法（略）化学降解法测序链终止法测序自动化测序非常规DNA测序（1）化学降解法测序(Maxam-Gilbert法）基本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学集团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解.技术路线将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同化学方法处理DNA,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,读取DNA的核苷酸顺序化学法测序（2）链终止法测序(thechainterminationmethod)基本原理:通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列ddAT