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第二章生物组织冷冻切片技术冷冻切片技术•冷冻切片（frozensection）是一种在低温条件下，将动物、植物组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而应用广泛。冷冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冷冻切片法，二氧化碳冷冻切片法，甲醇循环制冷冷冻切片法等。2.1CM1900简介•CM1900是徕卡奉献给广大用户用于各种已知低温冷冻切片的真正有效的仪器。冷冻切片机用来将生物组织的标本快速冷冻后，将标本在低温状态下进行微米级的超薄切片，为生物组织的分析研究提供快速优良的组织切片。•特点：·新型CM1900的特色之一是具有大型冷冻室，可冷却到-35°C。·该仪器还提供一个独立的样品冷却系统，样品夹温度的调节范围达到-10°C到-50°C，可进行不同类型的样品切片，每一样品托有各自独立的温度，并可在很短的时间内达到所需温度,快速冷冻台保持在-45°C，可同时放多达10个样品，并和一个可持续冷却的吸热器相连，可保证样品托上的样品快速冷却.高质量，无焊接缝的不锈钢冷冻室表面光滑，利于清洁和防止污染。规格参数：1.切片厚度：1至60um2.最大样品：55mm直径3.样品臂前后移动：25mm4.样品臂上下移动：59mm5.样品臂前后移动速度：0.8mm/秒冷冻箱温度:0至-35℃6.冷冻箱降温至:-35℃约4小时7.除霜功能:以热气9分钟除霜,可自由于24小时内设置开始时间8.可随时按制即时除霜.快速冷冻台:至-45℃9.机身大小(长/深/高):890/730/1200mm10.机身重量(连机切片):180kg11.独特双压缩作样品快速冷冻及稳定冷冻切片温度12.样品快速冷冻:-10℃至-50℃2.2操作2.3维护2.4故障排除2.5.冷冻切片的一点体会•取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为正方或长方体：1×1×0.5cm；0.5×0.5×0.5cm。•取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。•将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。•调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。•调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。•应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10--15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。2.6冰冻切片时的注意事项：•防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。•多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。•放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。•组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。•当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。•用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。2.7HE染色介绍•苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosinstaining)，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。•染色结果细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，很多细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。2.7.1试剂配置•0.5~1%的伊红酒精溶液：称取伊红Y0.5~1g，加少量蒸馏水溶解后，再滴加冰醋酸直至浆糊状。以滤纸过滤，将滤渣在烘箱中烤干后，以95%酒精（即工业酒精，如果不怕浪费，用无水乙醇配制也可）100毫升溶解。苏木素染液配方：(配制3000ml，可按比列减少)苏木精6g无水乙醇100ml硫酸铝钾150g蒸馏水2000ml碘酸钠1.2g冰醋酸120ml甘油900ml配制方法：将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。•1%盐酸酒精分化液：将1毫升浓盐酸加入99毫升70%酒精中即可。•促蓝液：1%浓氨水溶液（1：99）2.7.2改进的冷冻切片HE染色步骤•固定切好的切片用95%乙醇95ml+冰醋酸5ml固定1min,自来水冲洗。•染色用吸管将苏木素染液滴于玻片组织块上,放于酒精灯加热染色0.5-1min左右,自来水洗去染色液,用1%盐酸分化液分化2s,放入40℃温水中返蓝,再入伊红Y染液染色2s,递度酒精80%-95%-无水酒精各2S脱水,电吹风吹干。•封片中性树胶封片。