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实验一蛋白质及氨基酸的显色反应主讲:张丽霞Departmentoflifescience实验一、蛋白质及氨基酸的显色反应目的和要求1、学习和了解常用的几种鉴定蛋白质与氨基酸的方法。2、进一步认识氨基酸是蛋白质的基本组成单位。Ⅰ、双缩脲反应(Biureareaction)原理:双缩脲反应:在碱性条件下，双缩脲与二价铜离子作用，生成紫红色配合物的反应。当加热至180℃左右时，两分子尿素缩合脱去一分子氨，生成双缩脲。在肽和蛋白质分子中具有肽键，其结构与双缩脲类似，也能发生此反应，生成蓝紫色或紫红色的配合物。该反应常用于蛋白质的定性或定量测定。紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：蛋白质和多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。此反应所产生颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。操作步骤一、取少量尿素结晶，放入干燥试管中，用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷却后，加10%NaOH溶液约1mL，振荡混匀，再加入1%CuSO４溶液1滴，振荡之。观察出现的粉红颜色。避免添加过量硫酸铜，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。二、取另一支试管，加1mL卵清蛋白溶液和10%氢氧化钠溶液2mL，摇匀，再加1%硫酸铜溶液两滴，随加随摇，观察紫玫瑰色的出现。Ⅱ、茚三酮反应(Ninhydrinreaction)原理:除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应生成黄色物质外，所有的α-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。该反应分两步进行，首先是氨基酸被氧化，产生CO２、NH3和醛，而水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所生成的还原型茚三酮与另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为5-7。该反应十分灵敏，1：1500000浓度的氨基酸水溶液即能显示反应，是一种常用的氨基酸定量方法。操作步骤一、取2支试管分别加入蛋白质溶液和0.5%甘氨酸溶液1mL，再加0.5mL0.1%茚三酮水溶液混匀，在沸水浴中加热1-2min，观察颜色由粉色变成紫红色再变蓝。二、在一小片滤纸上滴上一滴0.5%的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴0.1%的茚三酮乙醇溶液一滴，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。Ⅲ、黄色反应(Xanthoproteicreaction)原理凡是含有苯环的化合物都能与浓硝酸作用产生黄色的硝基苯衍生物。该化合物在碱性溶液中进一步转化成深橙色的硝醌酸钠。在蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基易发生上述反应，而苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓硫酸催化才能呈明显的正反应。皮肤、指甲、头发等遇浓硝酸变黄即为这一反应的结果。操作步骤:一、取一支试管加4滴0.5%苯酚溶液，再加浓硝酸2滴，观察黄色出现，冷却后逐滴加入10%氢氧化钠溶液，观察颜色转变为橙色。二、取一支试管加蛋白质溶液4滴及浓硝酸2滴，由于强酸的作用，开始蛋白质形成白色沉淀，小火加热，则沉淀变为黄色，冷却，逐滴加入10%氢氧化钠溶液，颜色由黄色转变成深橙黄色。三、剪少许指甲或头发放入试管中，加入数滴浓硝酸，观察颜色变化。管号1234材料0.5％苯酚鸡蛋清液指甲头发量（滴)44少许少许浓硝酸（滴）422020现象加入NaOH后现象变化黄色反应Ⅳ、坂口反应(Sakaguchireaction原理在次溴酸钠或次氯酸钠存在的条件下，许多含有胍基的化合物能与α-萘酚发生反应生成红色物质。在20种氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它呈正反应。生成的氨被次溴酸钠或次氯酸钠氧化生成氮。该反应中过量的次溴酸钠或次氯酸钠是不利的，因其能进一步缓慢氧化，使产物破裂分解，引起颜色消失。但加入适量尿素可破坏过量的次溴酸钠。该反应灵敏度达1：250000。因此常用于定量测定精氨酸的含量和定性鉴定含有精氨酸的蛋白质。操作步骤取3支试管，分别加入1mL蒸馏水、0.3%精氨酸溶液和蛋白溶液，各加20%氢氧化钠溶液5滴，1%α-萘酚酒精溶液3滴，次氯酸钠溶液6滴，摇匀，放置片刻，观察出现的颜色。试剂（滴）管号H2O0.3％精氨酸蛋白质溶液20％NaOHα－萘酚NaClO现象记录１005536２050536３500536坂口反应Ⅴ、乙醛酸反应(Adamkiewica-Hopkins-Colereaction)原理在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质，反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。色氨酸在浓硫酸中与一些醛类反应也形成有色物质。很多人用含有少量醛杂质的冰醋酸或芳香醛等进行此反应。操作步骤向试管中加数滴蛋白质溶液，再加冰醋酸(常含有少量乙醛酸或醛类)约1mL并混匀倾斜试管，谨慎地沿着管壁加浓硫酸(AR)约1mL，使其重迭，且勿使二者混合。静置后，观察在两液界面上出现的红紫色环，于水浴中微热，可加快色环形成。用20%的白明胶作乙醛酸反应。观察结果。试剂（滴）管号白明胶蛋白质溶液（滴）冰醋酸（ml）浓硫酸（ml）现象记录15112113511乙醛酸反应Ⅵ、偶氮反应(Azoreaction)原理偶氮化合物(偶氮试剂)与酚核或咪唑环结合产生有色物质。它与酪氨酸和组氨酸反应的产物分别为红色和樱桃红色。含有酪氨酸和组氨酸的蛋白质也有此反应。操作步骤取2支试管，分别加入0.3%组氨酸溶液和纯鸡蛋清各4滴，再各加入新配制的重氮试剂8滴摇匀，加入2滴20%氢氧化钠溶液，再摇匀。过几分钟，观察颜色的形成，一般出现樱桃红色。试剂（滴）管号0.3％组氨酸（滴）鸡蛋清（滴）偶氮试剂20％NaOH溶液现象记录14822482偶氮反应反应名称反应基团反应产物及现象用途双缩脲反应肽键Cu—双缩脲络合物（兰紫色）测蛋白质含量和鉴定蛋白质水解是否完全茚三酮反应α-氨基酸兰紫色测AA含量、检验AA及蛋白质黄色反应苯环、Trp、Tyr黄色硝醌酸生成鉴定Trp、Tyr坂口反应胍基玫瑰红色产物生成鉴定Arg测定Arg含量乙醛酸反应吲哚环中间生成兰紫色环鉴定Trp偶氮反应咪唑基、酚核鲜红色物质生成鉴定His、Tyr试剂和器材一、试剂1.蛋白质溶液：取5mL蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后，用纱布过滤。2.0.1%茚三酮乙醇溶液：称取0.1g茚三酮，溶于100mL95%乙醇。临用前配制。3.尿素粉末4.1%硫酸铜溶液5.10%氢氧化钠溶液和20%氢氧化钠溶液6.0.5%苯酚溶液7.浓硝酸和浓硫酸(A.R.)8.0.1%茚三酮水溶液9.0.3%精氨酸溶液、0.3%组氨酸溶液、0.5%甘氨酸10.纯鸡蛋清11.1%α-萘酚乙醇溶液，临用时配制12.冰醋酸13.20%明胶溶液14.次氯酸钠溶液15.重氮试剂：溶液A：溶解5g亚硝酸钠于1000mL水中。溶液B：溶解5g对氨基苯磺酸于1000mL水中。溶解后，再加入5mL浓硫酸。A、B溶液分别保存于密闭瓶内。需用时，以1：1的比例混合。二、器材1.试管及试管架2.水浴锅3.酒精灯4.量筒(10mL)5.滤纸片6.烘箱实验注意事项：1.本次实验内容繁多，请严格按步骤操作，并做好实验报告。2.本次实验是定性实验，各种实验的现象都可能发生，要细心观察。3.本次实验有的试剂具强腐蚀性和刺激性，操作时要多加小心。思考题1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此时可对水解程度作出什么结论?2.能否用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在?3.白明胶对乙醛酸反应呈阴性，为什么?实验一蛋白质及氨基酸的显色反应主讲:张丽霞Departmentoflifescience