免疫组化及特殊染色

免疫组织化学技术Immunohistochemistrytechniques第一节免疫组织化学技术概述（一）发展简史1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。60年代Nakane建立酶标抗体技术运用铁蛋白标记Ab技术70、80年代多位科学家改良上述技术，建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶（PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC）法使免疫组织化学进入了应用阶段。2000年以后各种免疫组化技术更加成熟,使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。定义:是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记，在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。（二）免疫组织化学的原理抗原是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性病原微生物在医疗中将病原微生物制成疫苗进行预防接种，可以提高人的免疫力。嗜异性抗原一类与种属特异性无关的、存在于人以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。肿瘤抗原由物理的、化学的因素或某些病毒诱发的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤中心存在着与病毒密切相关的抗原。同种异体抗原动物免疫血清与人类有关的抗原抗体（antibody）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。世界著名抗体公司Santa公司、Abcam公司、Abgent公司、ProteintechGroup、CellSignalingTechnology（CST）、罗氏公司（Roche）它借助于荧光素、酶等标记抗体与组织切片或细胞涂片中相关抗原相结合，由于荧光素所发荧光可用荧光显微镜检出，而酶可经一定的显色处理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准确定位欲测定的抗原物质。标记物荧光素、酶标记抗体抗原荧光阳性色彩显微镜观察组织抗原抗体酶荧光素三大系统本技术是应用免疫学原理来识别待测抗原，再通过酶和底物的作用外加显色剂，将上述反应显示出来。免疫组织化学识别系统联结系统显示系统识别系统是指特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特异性结合是本技术的基本依据。联结系统由联结抗体构成。它的作用是联接识别系统和显示系统。显示系统的目的是使抗原抗体间的特异性结合变为肉眼可见。因此显示系统由标记酶，底物和显色剂组成，以在靶抗原存在位点上形成有色沉淀。特点：特异性强灵敏度高定位准确和简便快速等优点又能够将形态、功能及代谢的研究有机结合起来。IHC方法1过去用过的方法——ABC法，SP法。——三步法，使用生物素2目前最常用的方法——二步法：EnliVision显色系统（即用型非生物素免疫组化EnliVisionTMplus检测试剂盒）将多个抗鼠和抗兔的IgG分子二抗与辣根过氧化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大分子多聚体（polymer），直接放大信号40-50倍。敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。3最新一代的免疫组化NovolinkPolymer法：使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍，比传统中的大分子聚合物染色更显著），信号放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗原。IHC方法EnliVision法的工作程序：切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸，APES）H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出抗原决定簇），TBS漂洗内源性过氧化物酶的阻断一抗孵育，TBS漂洗二抗孵育，TBS漂洗DAB显色，蒸馏水中止反应苏木素复染及封片IHC技术的基本操作流程切片烤片脱蜡水化H2O2处理热修复一抗二抗Enlivision试剂DAB显色苏木素复染IHC染色结果的判读原则玻片干燥造成的“边缘效应”假阳性未阻止内源性过氧化物酶阻止内源性过氧化物酶后I.注意影响IHC结果判读的因素酒精固定福尔马林固定胰腺，insulin平滑肌肉瘤，SMA气泡影响抗体抗体反应冰冻切片石蜡切片结肠，CEA假阴性：注意内对照假阴性蛋白酶处理后蛋白酶未处理皮肤，IV胶原甲状旁腺，PTH微波未处理微波处理后II.染色的特异性判定MitochondoriaApicalmembraneBasolateralmembranePlasmaMembrane+PER・GolgiPlasmamembranePER+GolgiGolgiapparatusEndocrinegranuleEndocrinegranuleLysosomeCytosolNucleusCytoskeletonamylaselysozomePAcPS-100NSEprefixationdiffusionartifactCEAEMAALPCD10cytochromeP-450immunogloblinAFPHCGfactorⅧ-RAprolactininactivatedpituicyteSCEGFRE-cadLeu4HLA-DRCEA,EMA,SC,CA19-9incancercellLeu1LCAPALPinseminomacellCerb-B2SC,AFPEMA,immunoglobulininspecialconditionschromograninAserotoninPeptidehormoneDNApolymeraseS-100(occasional)estrogenreceptorkeratinincarcinoid,mesotheliomavimentinkeratininadenocarcinomahepatocyteactinkeratinvimentinGFAPtubulin各抗原在细胞内的显色方式细胞膜阳性细胞粘附分子：E-cadherin、CD31、CD56等交联膜蛋白分子：catenin、dystrophin等细胞表面受体：EGFR、c-erbB2、c-kit/CD117（酪氨酸激酶受体）等绝大多数白细胞抗原:LCA、CD20、CD2、CD5等表面或跨膜蛋白：Villin、BerEP4、EMA、CEA、CA125、EBV-LMP1等细胞核阳性细胞周期素蛋白：cyclins、cyclin依赖激酶(cdk)、cdk抑制剂(如p16)等细胞增殖相关蛋白：Ki67、PCNA转录因子：MyoD1、myogenin、TTF-1、CDX2、PAX5肿瘤抑制基因：如p53、p63、Rb、WT1基因错配产物：如MLH1、MSH2细胞核酶：如TdT类固醇激素受体：如ER、PR、AR细胞核钙结合蛋白：如S100蛋白、calretinin定位细胞核的病毒：如CMV、HBcAg（核+核周）NeuN：neuronalnuclei，表达于成熟的神经元细胞浆内颗粒状阳性--定位于细胞器溶酶体颗粒：如lysozyme、CD68、myeloperoxidase黑色素小体和前黑色素小体：如HMB45、Melan-A细胞毒颗粒：如TIA-1、granzymeB线粒体:如抗线粒体抗体,HEP-PAR1神经内分泌颗粒：各种激素（如PTH、ACTH、insulin）、CgA、SynW-P小体:F-VIII相关抗原分泌颗粒：如BRST-2、surfactant、PSA细胞内微生物：如弓形虫细胞浆纤维状阳性--中间丝或微丝中间丝;CK;Vimentin;DesminGFAP（glialfibrillaryacidicprotein，胶质纤维酸性蛋白）NF（Neurofilament，神经元胞浆——节细胞神经瘤，副节瘤/嗜铬细胞瘤，神经母细胞瘤）Nestin：巢蛋白，神经前体细胞弥漫或片状的细胞浆阳性蛋白分布在细胞内液、大量的微囊及内质网中如:myoglobin、hemoglobin、albumin、AFP、NSE、cytoplasmicIg、CD3病毒颗粒/蛋白如:HBsAg（常在核旁着色）从细胞间液吸收的蛋白如:Ig、albumin①分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断；②证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤；③应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌胚抗原（CEA）对胃肠道癌、甲胎蛋白（AFP）对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助；（三）免疫组化的应用④有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免疫球蛋白轻链κ和λ来鉴别滤泡性恶性淋巴瘤和滤泡性反应性增生；⑤研究某些癌症与病毒的关系，如肝癌与乙型肝炎病毒、鼻咽癌与EB病毒、宫颈癌与乳头状瘤病毒等的关系；⑥为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺癌检测雌、孕激素受体（ER、PR）呈阳性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗可预期获得较好的疗效；⑦检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如Ki-67，PCNA）用来估计肿瘤的预后。免疫组化在临床诊断中应用病例示范（Case1）临床病史资料：48岁，男性，胃活检标本取自胃大弯部位。H&E染色切片描述肿瘤细胞显示在间质中呈癌巢样，邻近的腺体肠上皮化生，间质中的不规则的巢状结构待诊断.H&E染色首先选择Cytokeratin单克隆广谱角蛋白抗体在细胞巢中呈强阳性染色，证明是上皮来源性的肿瘤，在图片顶部是非肿瘤性的腺上皮阳性，肿瘤性的腺体在底部。肿瘤细胞再进一步进行cytokeratin7/cytokeratin20染色，染色证实在肿瘤细胞中同时缺少cytokeratin7/cytokeratin20的表达。在这张图片中肠上皮细胞cytokeratin20阳性与邻近的肿瘤细胞阴性形成明显的对照。cytokeratin7and20在临床中使用中，如果同时都不表达，特异性地表示肿瘤细胞为来源于一些上皮的肿瘤（subsetofepithelialtumors），包括肾细胞癌，前列腺癌、肝细胞癌和神经内分泌肿瘤等。Synaptophysin测定Synaptophysin所有肿瘤细胞中都显示出较强的阳性表达，而在肿瘤细胞中包绕的肠腺体呈阴性诊断:神经内分泌癌Ki-67测定:Ki-67在肿瘤细胞呈现非常低的表达，Ki-67染色同样证实为肿瘤细胞增殖率低，肠腺上皮中Ki-67高表达，可能是胃小凹腺体，与高细胞增殖率的腺上皮相比Ki-67在肿瘤细胞中缺少胞核表达。这些Ki-67标记阴性的肿瘤细胞是低分级的神经内分泌癌细胞，第二节免疫组织化学染色前的基本技术(一)样品的取材组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。细胞标本后者包括组织印片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究.样品制备的第一步就是取材，取材的好坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工作。现将组织取材的原则和具体要求分述如下：1刀剪锐利、洁净。2快速、准确、尽量保持生活状态，力争1分钟之内放入固定液，最迟不能超过3分钟。3一刀切取，切取应在蜡版或滤纸上进行，避免拉锯、牵拉或挤压等动作。4低温操作，防止自溶现象，通常以0℃-4℃的低温条件下操作为佳。5、样品大小适当，光镜