第4讲 生物芯片技术简介及应用

面临问题恐怖袭击中遇见不明致病致命微生物，如何迅速确定？海关检查一批外来生物入侵物品，怎样在规定时间内迅速筛查，发现违禁生物物种？在医院里疲于奔命的血液检查，没完没了，周期长，抽血多，费用大。如何在第一时间精确诊断？研究一种新药的周期大约在10－15年，如何从数十万种化合物中迅速有效筛选出药物前体？神奇的芯片一次性的大规模筛查，微量的迅速的检测方法短时间内做成千上万次反应，而且理论上它的成本可以无限低生物芯片(biochip)于1998年被美国《Science》杂志评为世界十大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术。神奇的芯片世界著名的商业杂志《Fortune》1997年3月撰文对生物芯片技术作了如下阐述：“计算机微处理器重塑了我们的经济，为人类带来了巨大的财富，并改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变整个世界的面貌。”生物芯片技术是当代生物技术的重大变革！生物芯片技术及应用一、生物芯片的原理与技术背景二、生物芯片的分类三、技术基本过程四、生物芯片技术在临床中的应用五、生物芯片技术未来发展展望生物芯片技术及应用什么是生物芯片生物芯片(Biochip)主要指通过平面微细加工技术，在固体芯片表面等载体上的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。芯片上每平方厘米可密集排列成千上万个生物分子，能快速准确地检测细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分，并获取样品中的有关信息，其效率是传统检测方法的成百上千倍。是借用电子芯片的概念，是指能够快速并行处理多个样品并对其所包含的各种生物信息进行解剖的微型器件，它的加工运用了微电子工业和微机电系统加工中所采用的一些方法，只是由于其所处理和分析的对象是生物样品，所以叫生物芯片。什么是生物芯片类比分析：晶体管——集成电路——计算机芯片生物芯片——计算机芯片计算机芯片——电子信息生物芯片——生物分子携带的信息定义：生物芯片是一种可以快速地、高通量（并行）地处理生物信息的器件。生物芯片概念生物芯片技术是随着“人类基因组计划”的进展而发展起来的，它是上世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，它融微电子学、生物学、医学、化学、物理学和计算机科学为一体的高度交叉的新技术，不仅对基因功能具有重大的基础研究价值，而且也具有明显的产业化前景，可以说基因芯片已成为功能基因组研究中最基本的实验手段，没有生物芯片就无法真正启动功能基因组研究。因此被评为1998年度世界十大科技突破之一。生物芯片概念生物芯片研究–学科的紧密交叉精密仪器医学微电子学分子生物学生物信息学微流体力学化学药物学物理学材料学生物芯片检测的原理由于芯片上可以固定成千上万的探针，因此可以同时检测样本中成千上万的生物大分子。因此一次芯片实验就完成了成千上万个传统实验，即一次生物芯片反应是多次传统试验的集成。生物芯片（Biochip）是指包被在固相载体上的高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织的微点阵(microarray)。生物芯片检测的原理生物芯片能同时检测样本中的多个生物大分子，检测原理是利用特异性的分子间相互作用，如核酸杂交、抗原-抗体特异性结合、蛋白-蛋白间特异性结合等，将待测样品标记后与生物芯片反应，样本中的标记分子与芯片上的探针对号入座，标记的待测样本与之结合、反应后，通过激光共聚焦荧光扫描仪等检测手段获取信息，经计算机系统处理，分析得到信号值。信号值代表了结合在探针上待测的样本中特定的大分子的信息。生物芯片是高度集成的,机电一体化的检测系统,借助于计算机自动收集、储存、分析和报告检测信息，其主要特征是：高通量——提高信息量；平行化——提高信息的可比性；微量化——降低待测样品用量；自动化——提高工作效率；低成本——可迅速普及推广。生物芯片的主要特征20世纪，人类科学历程中有三大研究计划将永垂史册：人类历史上三大科学工程:人类基因组计划阿波罗登月计划曼哈顿原子弹研制计划人类基因组计划完成，随着疾病相关基因和功能蛋白不断发现，医学是最大的收益领域，大量的生物信息需要以整体、全面、定量、多学科、综合的模式来解决，医学界出现了以基因组、蛋白质组、抗原抗体谱为代表的新思维和体系。生命密码：分子解剖图人类基因组计划系统生物学:---整体大于(小于)部分之和!系统生物学是研究生物系统各构成组分相互关系的、以整合性为特征的大科学。其核心思想是“整体大于部分之和”。系统特性是不同组成成分、不同层次之间相互作用而“涌现”的新性质，对组成成分或低层次的分析不能真正的预测高层次的行为。系统生物学:---整体大于(小于)部分之和!生物信号传递生命活动：以物质代谢为基础以能量代谢为动力以信息调控为机制物质————物质不灭能量————能量守恒信息————信息传递新世纪的医学是以生物信息为核心的系统医学基因的结构或种类决定物种,基因的功能或表达则决定生命，即生物的生、老、病、死。基因是通过什么方式导致疾病的呢？基因是通过生物信息传递“DNA→RNA→蛋白质”途径决定健康与疾病的。因此又可以说任何疾病都是“信息病”，都与生物信号过强或过弱有关。从生物信息角度看传统医学是在下游信息即机体表型（症状、病理、生理）上获得诊断信息的，而未来医学是从DNA、RNA、蛋白质这些上游信息中获得诊断结果的，更具有确定性和预见性。未来的医学是以生物信息为核心的系统医学，DNA、RNA、蛋白质称为生物信息大分子，其质和量的异常变化与疾病直接相关，是一切疾病的根本原因。由于原有的测定方法已不能满足快速处理如此大量的疾病相关信息的需要，产生了生物芯片技术,由于人们需要简便、快速、小型、廉价的生物检测技术。低密度基因、蛋白芯片的出现就是针对这种需求而来的。生物芯片的标准有规则（ordered）显微尺度(microscopic)平面的(planar)特异性地吸附(specific)规则的阵列成行、成列大小均一、点间距相近位置明确规则的阵列能使芯片的制备、检测和分析快速准确的进行显微尺度的点显微尺度的定义是指一个物体若没有显微镜的帮助，不能被清楚地被看见。界限（1000µm）光化学合成15－30µm点制50－300µm组织芯片200-600µm基片上面的点直径必须小于1000µm显微尺度的点使高密度、微型化、自动化成为可能。平面基片平行不能弯曲的基质载体玻璃、塑料、硅片尼龙膜、硝酸纤维素膜平坦的表面适合于大规模的自动化生产。平面的材料使扫描和成像变得容易。特异性的吸附特异性的吸附是指溶液中的探针和芯片上对应的靶标分子之间发生专一的生化反应。利用特异性吸附可以定量分析一个基因或基因产物。不同于定性分析仅提供一个是与否的回答和估计。定量分析可以检测样品中某些分子的数目、数量或者浓度。由于芯片的制作方法和应用范围不同，可以将芯片分为不同的种类:1.以载体材料区分，可分为玻璃芯片、膜芯片、硅芯片和陶瓷芯片等。2.以制作方法区别，可分为原位合成芯片、直接点样法芯片（包括喷点和针点芯片）。3.以载体上的基因种类分，可分为寡聚核苷酸芯片、cDNA芯片、基因组芯片等。生物芯片的分类4.以芯片的应用区分，还可以分成用于检测基因表达水平的表达谱芯片、用于疾病检测的诊断类芯片、用于确定基因组中单核苷酸多态性的SNP分型芯片、用于中药材类分析的物种鉴定芯片、用于基因测序的DNA测序芯片等。5.根据基因芯片的应用，可以分为两大主要类型：用于对基因及其表达量进行检测的基因表达谱芯片和用于对待测样品的基因结构即组成进行检测的寡核苷酸芯片。生物芯片的分类生物芯片的分类生物芯片的分类基因芯片蛋白质芯片组织芯片芯片实验室根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片和功能生物芯片生物芯片的基本原理基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)一致，应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。蛋白质芯片的工作原理与经典的蛋白分子杂交方法(western)一致，应用已知蛋白质作为靶标与检测探针杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。生物芯片发展历史Southern、Northern、westernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray基因芯片又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片断或基因片段有序地、高密度地排列固定于支持物上，待测的样品核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的点按碱基配对原理同时进行杂交。杂交形式属于固－液杂交，与膜杂交相似。通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度而获得样品分子的数量和序列信息，用计算机软件进行数据比较和分析，从而对基因序列及功能进行大规模、高通量研究。基因芯片碱基互补原理微阵列芯片（点在玻璃基质上）乙型肝炎芯片点在尼龙膜基质上是用于基因功能研究的一种基因芯片，也是目前技术比较成熟、应用最广泛的一种芯片。表达谱基因芯片检测原理流程应用意义优点检测原理用不同的荧光染料通过逆转录反应将不同组织或细胞的mRNA分别标记成不同的探针，将探针混合后与芯片上的基因进行杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片，得到这些基因在不同组织或细胞中的表达谱图片，再通过计算机分析出这些基因在不同组织中表达差异的重要信息。1样品制备2DNA/RNA提取3荧光标记4分子杂交5信号检测6点阵分析检测步骤对来源不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（不同诱导、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。所以无论何种研究领域，利用表达谱基因芯片可以获得大量研究领域相关的基因，使研究更具目的性和系统性。应用的意义基因芯片在功能基因组研究中的应用根据基因表达谱的特征，进行疾病相关基因的识别与寻找。根据基因表达谱的变化研究，寻找新的药物作用靶点和效应基因分子，进行药物作用机理的深入研究。根据特征基因的表达水平，进行诊断、预后、分类。联合应用基因敲出，RNAi和基因芯片技术识别信号传到通路。与传统的杂交比较：(Northernblot)检测系统微型化，对样品等需要的量非常小同时研究上万个基因的表达变化，研究效率提高能更多揭示基因之间表达的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的作用关系检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰度相差几个数量级的表达情况节约费用和时间优点蛋白质芯片不是利用碱基配对而是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。蛋白质芯片构建的简化模型为：选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子（抗原或抗体），这样形成蛋白质的微阵列，即蛋白质芯片。如果加入与之特异反应的带有特殊标记的蛋白质分子，两者结合后，通过对标记物的检测来实现抗原抗体互检，即蛋白质的检测。此种方法构建的模型所需蛋白质的量极少，反应相对较快，蛋白质芯片稳定性可靠，灵敏度较高，比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面，因而在临床检测方面具有更加直接的应用前景。蛋白质芯片（ProteinChips)组织芯片技术又称组织微阵列（tissuemicroarray,TMA),是近年来发展起来的以形态学为基础的分子生物学新技术。组织芯片技术可以将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预先设计的顺序排列在一张玻片上进行分析研究，是一种高通量、多样本的分析工具。它使科研人员第一次有可能同时对几百甚至上千种正常或疾病以及疾病发