第八章 酶的定向进化

第八章酶的定向进化•利用酶作为催化剂进行生物催化与生物转化，已广泛应用于各个领域：医药方面、食品工业方面、轻工、化工方面、能源开发方面、环境保护方面等等•天然酶的局限：•酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求•而且天然酶的稳定性差、活性低使催化效率很低•还缺乏有商业价值的催化功能，尤其是对一些非天然底物具有惰性•在非水环境下的低活力•对辅酶的依赖等能具备长期稳定性和活性能适用于水及非水相环境能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料现代生物工程的要求•如何利用相对简单的方法以达到对天然酶的改造或构建新的非天然酶就显得非常有研究意义和应用前景试管中的进化是生物工程的未来——诺贝尔奖获得者M.Eigen内容简介•酶定向进化简介：基本原理、研究历史•定向进化的策略：无性进化、有性进化、同源重组•基因文库的构建与筛选：考虑要素、构建策略、构建载体系统、文库筛选•定向进化应用•定向进化优势、现状和未来1.研究历史•第一次在分子水平上定向改造单一分子的是SolSpiegelman在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行的一个实验，当时他的目的是为了证明达尔文的自然选择也可以发生在非细胞体。此实验并没有实际的应用价值•1981年，B.G.Hall等报道了他们定向改变大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。•1986年R。Hageman等进行了开发有效提高常温生物中酶分子热稳定性的实验。•将对卡那霉素有抗性的卡那霉素核苷酸转移酶基因转化进大肠杆菌，获得基因的突变库•将突变库转入可以在高温下生长的耐热菌，即嗜热脂肪芽孢杆菌中•通过在高温下进行筛选获得了一个在63℃下稳定的突变酶(Asp80Try)和一个在70℃稳定的突变酶(Asp80Try，Thr130Lys)2.基本原理•利用基因工程原理在实验室中模拟生物进化过程–化学进化–生物进化•生物的自然进化进化过程：突变→自然选择→遗传后代进化结果：基因多样性：为完成同一功能所表现出的多个基因或同一个基因(同源基因，或同工酶)代谢途径的多样性：同样产物，多条途径（木糖——木酮糖）代谢产物的多样性：同一底物，不同产物生物多样性：整个生态系统中的生物什么是定向进化技术•概念提出：•1993年，美国科学家ArnoldFH首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。•酶分子改造：–化学修饰，定点突变•定向进化•模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需方向发展的技术过程。定向进化与自然进化的异同点定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。两者的不同：•进化动力不同：保守突变非保守取代；•进化方向不同：适应突变的积累；•进化速度不同：非常漫长只需几年、甚至几天；•进化目标不同：适应环境超越生物学意义的要求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。•酶分子定向进化•模拟自然进化过程(随机突变+自然选择)，在体外对酶基因进行人工随机突变，建立突变基因库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有预先期望的具有某些特性的酶的突变体的技术过程。随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素500C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！–属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。•对酶分子的研究可以分为认识和改造两个方面，前者是利用各种生物化学，晶体学光谱学等方法对天然酶或其突变进行研究，获得酶分子特征，空间结构和功能之间的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息，以此为依据对酶分子进行改造，成为酶分子的合理设计。如化学修饰，定点突变等。澄清一个事实：定向进化不是定点突变•定向进化：突变筛选突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。•定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。3.定向进化的基本过程•随机突变•构建突变基因文库•定向筛选3.1随机突变•易错PCR技术•DNA重排技术(DNAShuffling)•基因家族重排技术易错PCR技术降低一种dNTP的量（降至5％-10％）加入dITP来代替被减少的dNTP缓冲液中另加0.5mmol/LMn2+提高Mg2+浓度•优点：简便，随机突变丰富•缺点：正突变率低，突变基因文库大，筛选工作量大。•适用于较小基因的定向进化DNA重组技术(DNAShuffling)1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段•DNA改组具有以下有用的特征：•①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的有利突变；•②重组可伴随点突变同时发生；•③可以删除个体中的有害突变和中性突变。•缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变会被有害突变的负背景所掩盖。•DNAshuffling技术的改进•交错延伸技术•随机引物体外重组技术交错延伸技术在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。随机引物体外重组技术•以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。基因家族重排技术酶切无引物PCR•Crameri等人在实验中选用了4个1.6kb来自不同菌属但同样编码头孢菌素C酶的基因，它们之间具有58％～82％的同源性。用这4个基因分别或共同作为出发序列进行DNA改组，把同样的转化子涂在含有16～32ug/ml的拉氧头孢的平板上，经过多轮改组进化，分别得到对拉氧头孢由最高抗性的菌株。3.突变体文库的构建突变基因突变体基因文库表达载体3.1文库质量要求•包容性：尽可能包含基因的任何一种可能的突变信息•完整性：尽可能完整反映基因的结构和功能信息，以便筛选得到具完整功能的进化酶•表达载体：•λ噬菌体载体系统：最早使用。适合大片段的克隆；转染率高，可达106以上；质量控制较好；适合长期保存。•质粒载体系统：体外操作简便，设计上具有很大的可塑性；能够实现对基因文库的功能型筛选。但：插入片段容量小，长片段再群体扩增时易丢失；转化效率较低；不能长期保存。•组装3.2突变库的筛选•1.定向选择环境条件的设定•逐步改变调整所设定的环境条件•2.高通量筛选•平板筛选•荧光筛选•噬菌体表面展示•酵母表面展示•核糖体展示平板筛选依据重组细胞的表型，包括细胞生长状态、颜色变化情况、透明圈情况等进行筛选。使抗生素失效的酶类(如头孢菌素酶，b-乳糖酶）提高耐热性易于观察的菌落表型（如菌落颜色等）营养缺陷型的辅助筛选噬菌体展示•根据所需要的特性，对经Shuffling后的DNA文库在噬菌体或细菌细胞表面（细菌、纤毛虫细胞表面）的表现特征进行筛选，获得提高目的底物亲和力的突变子。M13phage丝状噬菌体M13基因组是单链环状DNA主要外壳蛋白是基因VIII编码的蛋白质少量外壳蛋白是基因III、VI、VII和IX编码的蛋白丝状噬菌体的生活周期噬菌体显示筛选模式噬菌体显示的几种类型M13噬菌体pIII和pVIII的显示酵母双杂交展示•典型的真核生物转录因子（如GAL4）含有两个不同结构域:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)。•前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。•二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。•酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。•主要有二类载体:a含DNA-bindingdomain的载体;b含DNA-activatingdomain的载体。4.酶定向进化的应用•提高酶催化效率•改变底物特异性•改善酶的稳定性•获取具有新功能的酶•提高药用蛋白和疫苗的活性提高酶活力•L—天冬氨酸酶定向进化研究–进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。–得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶提高稳定性•T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4℃.•8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2℃提高底物的专一性•Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了9倍•Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功对映体选择性的定向进化•S型选择性的转氨酶转化ß-丁酮，仅有65%的手性专一性。•通过10000个随机突变的菌株的筛选，获得10个手性专一性在80%-94%之间的酶交换催化反应的专一性•来源于铜绿假单胞菌的脂肪酶对于底物p-硝基-苯基-2-甲基葵酸盐的S构型的选择性2%。•经过4轮易错PCR突变和筛选后，它对底物的S型的选择性达到81%Fig.1.Publicationrateofthe‘directedevolution’articlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004.TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase.Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywords‘directedevolution’intheirtitles.目标酶所需功能方法结果实施菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择在60-50℃酶半衰期增加200倍耐热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60％二甲基亚砜主仆女冠活力增强170倍枯草杆菌β-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性增加32000倍大肠杆菌对硝基苯酯酶有机溶剂中的底物特异性和活性易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性基因理疗交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌β-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特异性增加1000倍大肠杆菌砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌定向进化的应用展望总之，具有新功能和特性的酶可以通过从大量未知的自然种系中寻找以及对现有的天然酶进行改造，对现有的天然酶进行改造可能更加合适。我们相信，随着基因工程技术、蛋白质工程技术以及高通量筛选技术的迅速发展，定向进化技术将成为获得新酶的一个有效快捷的手段，这将为工业生产提供更多性能优良的酶制剂。参考文献NikolaosE.Labrou.Directedenzymeevolution:Bridgingthegapbetweennaturalenzymesandcommercialapplications.Biomolecula