12微生物分子生态学研究方法

微生物分子生态学的一些研究方法微生物群落结构和多样性是微生物生态学研究的热点内容。群落结构决定了生态功能的特性和强弱。群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。群落结构变化是标记环境变化的重要方面。通过对环境微生物群落结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。•20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。微生物群落结构和多样性研究方法：•在70和80年代：对微生物化学成分的分析，建立了一些微生物分类和定量的方法（生物标记物方法），对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代：现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息。虽然可以检测环境中的活细胞，并且对微生物生态学的发展起了很重要的作用。采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少（不到1%）。Amann等人报道在自然环境样品中可培养的微生物占总的微生物数量的比例范围从0.001%（海水）到0.3%（土壤）。不能全面地反映微生物区系组成状况，烦琐、耗时。1、传统的微生物培养法2、群落水平生理学指纹方法(CLPP)微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子之一。由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理学指纹方法(CLPP)，通过检测微生物样品对底物利用模式来反映种群组成的酶活性的分析方法。具体而言，CLPP就是通过检测微生物样品对多种不同的单一碳源的利用能力，来确定哪些基质可以作为能源，从而产生对基质利用的生理代谢指纹。BIOLOG鉴定系统自动化、快速可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝状真菌。每个孔中含有不同的底物菌悬液或无菌水仅能鉴定快速生长的微生物，误差较大（pH），拥有的标准数据库还不完善在96孔细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源（95种）利用情况。干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑微生物利用碳源进行呼吸时（产生的NADH），会将四唑从无色还原成紫色。3、生物标记物法（Biomakers）•生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其总量通常与相应生物量呈正相关。•特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹估价微生物群落结构。•首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环境中提取出来，然后对提取物进行纯化，后用合适的仪器加以定量测定。优点：不需要把微生物的细胞从环境样中分离，能克服由于培养而导致的微生物种群变化，具有一定的客观性。醌指纹法(QuinonesProfiling)呼吸醌广泛存在于微生物细胞膜中，在电子传递链中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone辅酶Q)和甲基萘醌(menaquinone维生素K)。醌可以依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的氢原子数进一步区分。每一种微生物都含有一种占优势的醌，而且不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。醌指纹法具有简单快速的特点。•磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。磷脂脂肪酸（phospholipidfattyacid,PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fattyacidmethylester,FAME）谱图分析•脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。•甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，气相色谱分析系统分析出全细胞的FAME谱图。•脂肪酸谱图法分类水平较低，不能鉴定到种。另外，不同微生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。•磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。4.ERIC(肠杆菌基因间保守重复序列)-PCR指纹图谱技术•DiGiovanni等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，比常规RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。•在微生物群落中，各细菌数量占1-10%时，其特征性ERIC-PCR主条带就可以在指纹图中表现出来。ERIC-PCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种不同微生物的基因组DNA片段，条带的数目反映微生物类群的多少，条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低。•分析不同环境样品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指纹图谱的差异，就可比较不同生态系统微生物群落的差异，或者同一个群落在不同功能状态下的结构变化。E1:5'-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3'E2:5'-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3'ERIC-PCR引物20pmol/μl5.以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法•用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列包括：核糖体操纵子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重复序列和随机基因组序列等。•最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定，同时含有保守序列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要指标。Diversityestimationbasedonmolecularmarkers实验原理•16SrDNA是基因组的“biomarker”•–核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16SrDNA广泛存在于所有原核生物的基因组中。•–16SrDNA的序列中包括保守区和可变区。•–序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应，而且一般不发生水平转移。•–GeneBank和RDPⅡ（RibosomalDatabaseProject）数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释的16SrDNA序列，可供进行比对。16SribosomalRNAPresentinalllife•molecularchronometer–taxonomy(largedatabase)–evolutiononeactivebacterialcell:–~104copies–~15rRNAgenes(i.e.,rDNA)(Mycobacteriumtuberculosis,Mycoplasmapneumoniae,Sulfolobussolfataricuswith1copy,Clostridiumparadoxumwith15copies)~1500nt(enoughinformation)–fourdifferentdomains–conservedregions(novariationamongalllife)–variableregions(V1-V9)Source:Louis,B.,GeneIV,1997环境16SrDNA文库的构建与组成分析技术•1990年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性。•16SrDNA文库中的蓝藻种类与培养出来的蓝藻很不一致；•发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群；•与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生物多样性；•这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环境当中前所未知的微生物的多样性。构建环境16SrDNA文库的方法•用环境基因组总DNA进行16SrDNAPCR扩增：把环境中几乎所有微生物基因组上的16SrDNA扩增并收集到一起。•universalprimers:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(Esherichiacolibases8to27)和5’-TACCTTGTTACGACTT-3’(E.colibases1507to1492)•“TA克隆”：把每一个16SrDNA分子放到文库中的每一个克隆里。阳性克隆筛选的过程：•1.Amp抗性，挑选出含有质粒的克隆•2.蓝白斑筛选，挑出带有插入片段的克隆•3.PCR筛选，挑出带有正确长度插入片段的克隆ARDRA分型与测序各OTU含有的克隆数量克隆文库的统计分析TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphism(T-RFLP)f-primerr-primerPCRCUTABCABCcommunityDNA(ABC)internalsizefragmentPAGEonSEQUENCER16SrDNAFragmentSize(basepairs)ABCRelativeIntensityLiuetal.,1997,AEM变性梯度凝胶电泳（DGGE）•变性梯度凝胶电泳（Denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。•Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。•此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。原理•双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。•DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。•一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain,MD)和解链行为(meltingbehavior)。•一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加各区域依次发生解链。•显示的是一个234bp长的DNA片段的解链区域，横坐标是该DNA片段的序列，依次从第一个碱基到第234个碱基；纵坐标是解链温度。该DNA片段共有3个解链区域。•MD1是解链温度最低的一个解链区域，MD3是温度最高的一个解链区域。•不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。•当它们进行DGGE时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。•一旦DNA片段迁移到一定位置，其变性剂浓度使双链DNA片段最低的解链区域解链，部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，不同的DNA片段会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。•然而，当变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域温度时，DNA片段会完全解链，此时它们又能在胶中继续迁移，这些片段就不能被区分开来。•在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30-50个碱基对）可以解决这个问题。•含有GC夹子的DNA片段解链温度很高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。•当加了GC夹子后，DNA片段中每个碱基处的序列差异都能被区分开。•当用DGGE/TGGE技术来研究微生物群落结构时，要结合PCR（polymerasechainreaction）扩增技术，用PCR扩增的16SrDNA产物来反映微生物群落结构组成。•通常根据16SrRNA基因中比较保守的碱基序列