7亲和膜分离

膜亲和过滤法1概述亲和分离技术被认为是解决生物工程下游产品回收和纯化的高效方法。亲和分配、亲和沉淀、亲和色谱等技术正在迅速发展，其中亲和色谱已成为色谱领域中的一个重要分支，它的选择性和特异性极强，是其他技术无法比拟的，但填充亲和色谱柱技术在发展中遇到某些固有限制，如流速低、填充颗粒的压缩、扩散传递慢，故造成柱效率不高并且不易大规模应用。在亲和分离技术发展的同时，膜分离技术作为生物大分子纯化分离的一个有力工具也获得了迅速的发展，其特点是处理量大，可以大规模操作，但由于是利用膜孔径大小来分离，纯度相对较低。膜分离和亲和色谱两种技术各有自己的特长和不足。为了弥补上述不足，自80年代中期以来，已有人把这两种技术有机地结合起来，发挥各自的长处，于是出现了膜亲和过滤方法。这一方法实际上包括两个分支：①亲和膜分离技术，制备带有亲和配基的分离膜，直接进行产物分离；②亲和-错流膜过滤，将水溶性或非水溶性高分子亲和载体与产物进行特异反应，然后用膜进行错流过滤。项目膜分离亲和色谱原理利用膜孔径大小利用化学和生物特异性相互作用过程一般为低压，可连续操作低、中、高压都有，一般为断续式操作介质板式、卷式、中空纤维式超滤或微孔滤膜担体、填料，一般在柱中进行规模处理量大，可达克、甚至千克级处理量小，大多为毫克级，制备级可达克级成本相对较低很高设备较简单较复杂速度快较慢产物纯度相对较低纯度很高2亲和膜分离技术亲和膜分离技术首要的是要研制出一种有效地用于生物大分子纯化分离的“亲和膜”（AffinityMembrane，简称AM）。制备亲和膜关键是要选择合适的膜材料，并对膜进行表面化学改性（SurfaceModification）。2.1亲和膜分离基本理论简介由于亲和膜分离过程非常复杂，故到目前为止真正基于物理-化学-生物特异性相互作用的理论关系式还未建立，最初基于配基-蛋白质相互作用的吸附-解离平衡过程所提出的亲和模型有一定的局限性，最近Suen用对流、扩散和Langmuir吸附理论对亲和膜分离过程作了数学分析，推导出了蛋白质和配基之间形成的络合物浓度与蛋白质浓度和配基浓度之间的关系式。膜越薄，轴向扩散的影响越显著，允许使用的流速越低，用薄膜堆积成厚膜，可降低轴向扩散的影响，有利于提高操作速率，增加样品负荷容量，缩短分析时间2.2亲和膜分离过程和操作方式亲和膜分离过程实现膜上亲和分离需要解决的几个关键问题亲和膜的分离操作方式2.3亲和膜分离设备1-交联或活化试剂2-酶或蛋白溶液3-灭菌过滤器4-中空纤维分离器5-预置过滤器6-料液7-切换阀8-清洗液9-产物或纯化物中空纤维式酶膜反应器2.4亲和膜分离技术的应用Krause等人从大肠杆菌培养液中纯化苹果酸脱氢酶，经3次亲和膜操作，可以达到纯化比为200倍，回收率超过90%，可以用于纯化产品。Zale等人对于蛋白A/IgG、外源凝集素/IgG、肝素/抗凝血酶Ⅲ、抗体因子Ⅷ/因子Ⅷ等系统的实验表明，原亲和色谱中所受扩散速度限制已被克服，亲和膜分离过程速度受控于配体-配基间缔合动力学。各种亲和膜的特征不同，应用也有些差别（酶及血清蛋白的纯化，肽、蛋白质及酶的固载化，单抗和多抗的分离，抗原、抗体、重组蛋白及酶的纯化，细胞生长剂、IgG、干扰素的纯化，RNA、DNA转录、中性蛋白纯化，胰蛋白酶抑制剂的分离）2.5亲和膜分离技术应用研究进展从20世纪80年代开始的亲和膜研究，在90年代得到了蓬勃发展，特别是KleinJ的专著及1995-1998年期间发表的3篇综述文章，所作出的对亲和膜制备、过程及应用方面的总结与评价、存在问题及改进措施对于亲和膜分离研究与发展具有推动作用。基膜材料的开发与应用：性能稳定的亲和膜材料及其相应的亲和膜的研究报道较多．在亲和膜材料的选用方面，纤维素、壳聚糖、聚偏氟乙烯、尼龙等应用较多.比较典型的如suen以聚偏氟乙烯为基膜材料，用金属离子作配基，纯化肝细胞生长因子；Castilhou用尼龙膜固定不同配基，分离免疫球蛋白。此外，亲和膜的制备方法与结合机理，膜孔径大小对亲和配基结合率影响，轴向的压力降，膜组件内的流动状态，等方面也有相关报道。国内的发展比较晚起步，从1995年开始才出现亲和膜方面的相关报道，虽然发展比国外晚了7年，但是近几年还是得到了较快的发展，研究范围涉及基膜改性、亲和吸附、动力学研究和亲和膜应用。3亲和-膜过滤亲和-膜过滤又称亲和过滤（AffinityFiltration）或亲和超滤（AffinityCross-FlowFiltration简称ACFF），是1981年由Hedda等人首先提出并得到迅速发展的一种新型大规模分离纯化技术。这一技术是生物化学、化学工程和生物工程等多门学科的前沿交叉点，它将亲和层析和膜过滤特别是超滤技术有机地结合起来，兼有亲和层析和膜过滤的优点，从而成为目前研究的热点。3.1亲和-膜过滤的特点因为亲和-膜过滤是亲和层析与膜过滤相结合的技术，所以先分别简要介绍一下这两者的优缺点。亲和层析是目前分离选择性最好、纯化倍数很高的一种生物技术产品的实验室常用分离纯化方法。其原理是利用生物大分子及其配基（例如酶与底物或抑制剂，抗体与抗原，激素与受体等）之间的生物特异性与可逆的亲和作用，专一性地吸附生物大分子而达到分离纯化的目的。亲和层析的优点是简单、快速，甚至从细胞的粗提液中经一步层析就能纯化成百上千倍。此外配基对相应的蛋白质有稳定作用，故使蛋白质的回收率和比活力比较高，并且亲和性的吸附剂可反复使用。但亲和层析是一种昂贵的分离技术，作为一种间歇操作的吸附色谱，柱中装载的昂贵的亲和载体利用率很低，由于使用粒径小、强度低的亲水性载体，柱的通量小，易被堵塞和污染，传质阻力大，造成过程速率很低，大柱中的流动状况复杂，装柱技术的熟练程度和经验对柱的性能影响很大，放大困难，故到目前为止还主要用于纯度要求很高、价格昂贵的小量产品的生产上。至于膜分离技术，从60年代发展至今，已在生物技术领域中得到了广泛的应用。特别是超滤，以压力为驱动力，溶质按分子大小不同而分离，过程无相变化，能耗小，不需添加化学试剂，易于大规模操作。但超滤技术的选择性差，不能把相对分子质量相近的生物分子分开。新近发展起来的亲和-膜过滤特点是同时体现了亲和层析中生物特异性吸附的优点及膜分离可大规模操作的优点，将“亲和载体”（水溶性和非水溶性）分散在溶液中进行吸附，避免了固定床操作带来的种种缺点，使亲和-膜过滤技术具有很强的生命力。3.2亲和-膜过滤过程亲和-膜过滤的“主角”是一种叫做“亲和载体”的粒子（AffinityEscort）。亲和载体的结构包括一个由对生物分子无特异吸附性的物质组成的内核以及内核表面上连接的某些特定基团，这些基团必须对所提取的蛋白质有一定的特异吸附性。内核表面放大3.2亲和-膜过滤过程亲和载体一般必须拥有以下两种特性之一，或能溶于水溶液，或易于悬浮在水溶液中。之所以对载体有上述要求是因为在操作过程中，这些载体必须易于用泵来进行转送。3.2亲和-膜过滤过程亲和载体由于具有了上述的特殊结构，因此可以与分离对象蛋白质选择性地结合形成复合体，然后再用膜对加入载体的发酵液进行过滤并保留复合物，而那些杂蛋白则随液体流过膜，从而实现了分离对象与杂蛋白的分离与纯化。得到的复合体，只需改变缓冲液以释放结合在亲和载体上的蛋白，同时进行第二次膜过滤，就可以将分离对象与载体分离，载体在进行重新复活处理后还可循环使用，见图3.2。图3.2亲和-错流过滤流程总图重新调节解吸缓冲液原液杂质产品缓冲液吸附载体循环使用亲和-载体杂质产品膜3.3亲和膜过滤的关键问题亲和载体的制备通常有两种途径，采取哪一条途径与内核的性质密切相关。而载体的内核有两种类型，一种是水溶性的大相对分子质量聚合物，另一种是非水溶性的粒子。当用不溶于水的粒子作为亲和载体的内核时，载体所能吸附的最大蛋白量受粒子表面积的限制。要想让载体尽量多地结合蛋白，就必须让粒子具有尽量大的表面积，也就是说要求粒子的直径尽可能小，这一原则与亲和层析中粒子要小的原则是一致的。以水溶性物质作为亲和载体内核与非水溶性内核相比，由于它分散在水相中，所以这种载体与分离对象的结合更为有效并更为迅速。而且由于水溶性内核在水溶液中的可伸展性，使它的表面基团在与蛋白结合时，消除了空间障碍，大大提高了过程速率。可见能否成功地开发性能优良的水溶性高聚物亲和载体，是亲和-膜过滤能否达到高效低成本及其在生物技术产品大规模分离提纯中成功应用的主要因素之一。3.4亲和-膜过滤基本理论简介亲和作用的一般理论渗析理论亲和-错流过滤模型3.5亲和-膜过滤的应用亲和-膜过滤技术研究最早报道见于1980年。PatrickHubert等人将雌二醇当作配基联接在水溶性载体Dextran-T2000，用于从Pseudomonastestosteroni提取物中纯化ᅀ5-4酮甾醇异构酶，截留率为90%，但杂蛋白的截留率也比较高，这可能是由于目标产物与杂蛋白形成复合物或配基与杂蛋白结合所致。DominiqueAdamski-Medda等以对氨基苯甲脒为配基联接于Dextran-T2000载体上，用于从胰酶和胰凝乳蛋白酶混合物中纯化胰酶，胰酶的回收率为90%，纯度为98%。除此之外，亲和-膜过滤还可用于β-半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶、辣根过氧化酶、IgG等的分离提纯。思考题比较膜分离和亲和层析分离的特点；在亲和分离技术中，亲和剂由哪几部分组成？简述亲和膜的分离过程亲和膜分离过程微孔滤膜或超滤膜放大图：亲和膜分离过程1.分离膜的改性基于在微孔滤膜或超滤膜上所具有的某些官能团，通过适当的化学反应途径，将其改性，接上一个间隔臂（Spacer），一般应是大于3个碳原子的化合物。Spacer亲和膜分离过程2.亲和膜制备选用一个适合的亲和配基（Ligand），在一定条件下让其与间隔臂分子产生共价结合，生成带有亲和配基的膜分离介质。Ligand亲和膜分离过程3.亲和络合将样品混合物缓慢地通过膜，使样品中欲分离的物质与亲和配基产生特异性相互作用，产生络合，生成配基和配位物（Ligate）为一体的复合物（Complex），其余不和膜上配基产生亲和作用的物质则随流动相通过膜流走。样品混合液样品混合液LigateComplex亲和膜分离过程4.洗脱改变条件，如洗脱液的组成、pH值、离子强度、温度等，使复合物产生解离，并将解离物收集起来，进一步处理。洗脱液洗脱液亲和膜分离过程5.亲和膜再生将解离后的亲和膜进行洗涤、再生、平衡，以备下次分离操作时再用。再生处理液再生处理液实现膜上亲和分离需要解决的几个关键问题1.膜表面要有足够多并可利用的化学基团（一般为-OH，-NH2，-SH或-COOH基），使其能进行活化，接上合适的间隔臂和配基。2.要有足够数量可利用的化学基团则必需有足够高的表面积，要便于让生物大分子自由地出入膜，必需有足够大的孔径。3.孔分布应窄而均匀，以获得高的通透量和分离效能。4.为了实现快速分离，常要加压操作，因此要求膜有一定的机械强度，能承受一定的压力，长期使用不变形。5.亲和膜要耐酸、耐碱、耐高浓度的缓冲夜和有机溶剂。亲和膜的分离操作方式1.亲和超滤过程，在大多数情况下都使用错流方式（CrossFlow）。这种方式的优点是膜有双重的分离作用，不仅所需要的生物大分子可以获得分离，而且可去除部分溶剂，达到浓缩的目的。亲和膜的分离操作方式2.微孔亲和膜过滤过程，混合物通过膜时，只有和膜亲和配基产生相互作用的物质被滞留在膜上，其余物质均随冲洗剂通过膜流走，目前大部分亲和操作采用此种方式。亲和膜的分离操作方式亲和膜组件的形状有板式、圆盘式、中空纤维式等，前两种较为简单、成本低、容量小，中空纤维式则便于实现连续、自动、规模化操作。