第九章 核酸提取和鉴定

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第九章核酸的提取与鉴定第一节核酸提取提取核酸的种类:基因组DNA质粒DNA总RNAmRNA核酸提取的总原则⒈保证核酸一级结构的完整性;⒉防止污染(蛋白质、多糖、有机溶剂等);⒊防止核酸降解;核酸提取的基本步骤⒈破碎细胞;⒉除去其他生物分子;⒊分离核酸;⒋除去杂质;⒌鉴定和储存一、质粒DNA的提取质粒:游离于细菌染色体之外的遗传物质,特点:闭环双链DNA1~300kb能够复制质粒DNA提取的基本步骤:⒈培养细菌和扩增质粒⒉收获细菌和溶菌⒊提取质粒⒈培养细菌和扩增质粒培养条件:37℃,液体培养基中,150-250r/min的摇床旋转的条件下培养细菌;为增加质粒拷贝数可加入氯霉素;生长情况:大肠杆菌每20min分裂1次,直到最大密度⒉收获细菌和溶菌收获细菌:离心收集细菌细胞沉淀,弃上清培养液;溶菌:破坏细胞壁和细胞膜机械法:超声波、捣碎机、匀浆器等;1.溶菌酶:破坏细胞壁溶菌酶-化学试剂联合法:3.去污剂:SDS(十二烷基硫酸钠);TritonX-100(曲拉通X-100)等,作用:溶解细胞膜。2.EDTA(乙二胺四乙酸盐):螯合Ca2+(维持细胞壁必需)⒊提取质粒:去除染色体DNA原理:1.质粒DNA和染色体DNA的分子大小不同:质粒DNA分子量小2.质粒DNA和染色体DNA的结构不同:染色体DNA断裂成线状片断质粒DNA环状DNA提取方法:⑴氯化铯密度梯度分离法方法:细菌裂解液+氯化铯+溴化乙锭(EB)超速离心氯化铯密度梯度离心溴化乙锭(EB):降低线形DNA的密度⑵碱裂解法pH12(NaOH和SDS)染色体DNA片段变性解链;质粒DNA部分解链将pH调回中性(乙酸钾)变性的染色体DNA片段相互缠绕,且与蛋白质结合沉淀;离心上清液:质粒DNA;沉淀:染色体DNA和蛋白质;⑶煮沸裂解法加热:使蛋白质和染色体DNA变性降温:质粒DNA复性,染色体DNA不能复性二、真核生物基因组DNA组织DNA的提取(SDS/酚法)原理:SDS裂解细胞,然后用酚使蛋白质变性,与水溶性DNA分离。水相(DNA)中间层(变性蛋白质)有机相组织DNA的提取过程(4℃/灭菌器皿)匀浆组织SDS蛋白酶KEDTA酚/氯仿抽提乙醇沉淀重新溶解DNA(TE缓冲液)分离组织细胞离心取上层水相水相/有机相裂解细胞降解蛋白质抑制DNase蛋白质变性提取DNA三、真核生物RNARNA提取的关键:建立一个无RNase的环境RNase的特点:分布广、耐高温具体操作:⒈玻璃器皿:200℃,烘烤4小时;⒉使用一次性无RNase的塑料制品;⒊溶液:用0.1%DEPC水配制及未开封试剂配制;⒋操作人员戴一次性口罩和手套;⒌操作环境:超净台、冰浴;匀浆组织4℃/细胞裂解液(异硫氰酸胍、巯基乙醇、SDS等)苯酚/氯仿抽提乙醇沉淀重新溶解RNA(DEPC水)㈠总RNA的提取:热酚法取上层水相离心㈡mRNA的提取Oligo(dT)-柱层析法原理:真核mRNA3`端具有poly(A)利用具有Oligo(dT)-层析柱分离;四、核酸纯度鉴定方法:紫外吸收法核酸浓度测定:1OD值相当于50g/ml的双链DNA相当于40g/ml的单链DNA或RNA核酸浓度计算公式:双链DNA浓度(g/ml)=OD260×稀释倍数×50/1000单链DNA或RNA浓度(g/ml)=OD260×稀释倍数×50/1000核酸纯度测定:DNA样品:OD260/OD280≈1.8RNA样品:OD260/OD280≈1.8-2.0第二节核酸凝胶电泳电泳:带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象;+-双链DNA的电泳负极到正极:分子量由大到小根据支持物分为:一、琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳的分类电泳槽(垂直和水平)电泳仪电泳装置一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是红色海藻产物琼脂中提取的一种多糖,加热到沸点后再冷却凝固就形成了良好的电泳介质;主要试剂:琼脂糖电泳缓冲液:TBE(Tris、硼酸、EDTA)上样缓冲液:溴酚蓝、二甲苯青、蔗糖染色剂:溴化乙锭操作:⒈选择琼脂糖种类、确定浓度(根据核酸分大小);琼脂糖凝胶浓度(%)分离DNA的有效范围(Kb)0.35~600.61~200.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~32.00.1~2琼脂糖凝胶浓度与分离DNA的有效范围⑴加缓冲液⑵加热:90度左右⒉制胶⑶灌胶,插入梳子(冷却40-45度后凝固);⑷将凝胶置于电泳槽中;⑸加入电泳缓冲液,拔出梳子⒊上样:样品与上样缓冲液混合,加入胶孔中;⒋接通电源,进行电泳;上样缓冲液的作用(监测电泳的进程;增加样品密度)溴酚蓝(200bp)二甲苯青(1600bp)1.4%琼脂糖凝胶⒌染色:溴化乙锭:一种荧光染料,和双链DNA结合后,在紫外光照射下发橙黄色荧光;⒍检测:紫外透射仪、凝胶呈像分析系统凝胶电泳的应用⒈核酸分子量的检测⒉鉴别分子量相同而构型不同的DNA分子⒊RNA样品质量的检测28SrRNA18SrRNA二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶:由丙烯酰胺和N,N`-甲叉双丙烯酰胺在TEMED和过硫酸铵的催化下聚合而成。特点:凝胶孔径较小;分辨率高(相差一个bp的DNA);适合分离5-500bp的DNA;聚丙烯酰胺凝胶电泳分类变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离单链DNA)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离双链DNA)连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳第三节DNA测序一、Sanger双脱氧链终止法二、Maxam-Gilbert化学降解法三、DNA测序自动化一、Sanger双脱氧链终止法⒈建立体外DNA合成体系:待测序DNA标记引物DNA聚合酶4种dNTPddNTP⒉调整dNTP和ddNTP的比例,新合成的DNA链可能在任何位置加入ddNTP,导致合成终止,得到一系列长度不同的DNA片段⒊变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离合成的DNA片段⒋放射自显影读出DNA序列(和待测DNA互补)二、Maxam-Gilbert化学降解法⒈制备标记片断(四个化学降解反应体系)反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主要断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯甲基化脱G六氢吡啶GG+A甲酸脱A/G六氢吡啶G+AC+T肼C/T开环六氢吡啶C+TC肼+盐C开环六氢吡啶C⒉读序三、DNA测序自动化

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