第九章 核酸提取和鉴定

第九章核酸的提取与鉴定第一节核酸提取提取核酸的种类：基因组DNA质粒DNA总RNAmRNA核酸提取的总原则⒈保证核酸一级结构的完整性；⒉防止污染（蛋白质、多糖、有机溶剂等）；⒊防止核酸降解；核酸提取的基本步骤⒈破碎细胞；⒉除去其他生物分子；⒊分离核酸；⒋除去杂质；⒌鉴定和储存一、质粒DNA的提取质粒：游离于细菌染色体之外的遗传物质，特点：闭环双链DNA1~300kb能够复制质粒DNA提取的基本步骤：⒈培养细菌和扩增质粒⒉收获细菌和溶菌⒊提取质粒⒈培养细菌和扩增质粒培养条件：37℃，液体培养基中，150-250r/min的摇床旋转的条件下培养细菌；为增加质粒拷贝数可加入氯霉素；生长情况：大肠杆菌每20min分裂1次，直到最大密度⒉收获细菌和溶菌收获细菌：离心收集细菌细胞沉淀，弃上清培养液；溶菌：破坏细胞壁和细胞膜机械法：超声波、捣碎机、匀浆器等；1.溶菌酶：破坏细胞壁溶菌酶-化学试剂联合法：3.去污剂：SDS(十二烷基硫酸钠)；TritonX-100（曲拉通X-100）等，作用：溶解细胞膜。2.EDTA(乙二胺四乙酸盐)：螯合Ca2+(维持细胞壁必需)⒊提取质粒:去除染色体DNA原理：1.质粒DNA和染色体DNA的分子大小不同：质粒DNA分子量小2.质粒DNA和染色体DNA的结构不同：染色体DNA断裂成线状片断质粒DNA环状DNA提取方法：⑴氯化铯密度梯度分离法方法：细菌裂解液+氯化铯+溴化乙锭（EB）超速离心氯化铯密度梯度离心溴化乙锭（EB）：降低线形DNA的密度⑵碱裂解法pH12（NaOH和SDS）染色体DNA片段变性解链；质粒DNA部分解链将pH调回中性(乙酸钾)变性的染色体DNA片段相互缠绕，且与蛋白质结合沉淀；离心上清液：质粒DNA；沉淀：染色体DNA和蛋白质；⑶煮沸裂解法加热：使蛋白质和染色体DNA变性降温：质粒DNA复性，染色体DNA不能复性二、真核生物基因组DNA组织DNA的提取（SDS/酚法）原理：SDS裂解细胞，然后用酚使蛋白质变性，与水溶性DNA分离。水相（DNA）中间层（变性蛋白质）有机相组织DNA的提取过程(4℃/灭菌器皿)匀浆组织SDS蛋白酶KEDTA酚/氯仿抽提乙醇沉淀重新溶解DNA(TE缓冲液)分离组织细胞离心取上层水相水相/有机相裂解细胞降解蛋白质抑制DNase蛋白质变性提取DNA三、真核生物RNARNA提取的关键：建立一个无RNase的环境RNase的特点：分布广、耐高温具体操作：⒈玻璃器皿：200℃，烘烤4小时；⒉使用一次性无RNase的塑料制品；⒊溶液：用0.1%DEPC水配制及未开封试剂配制；⒋操作人员戴一次性口罩和手套；⒌操作环境：超净台、冰浴；匀浆组织4℃/细胞裂解液（异硫氰酸胍、巯基乙醇、SDS等）苯酚/氯仿抽提乙醇沉淀重新溶解RNA(DEPC水)㈠总RNA的提取：热酚法取上层水相离心㈡mRNA的提取Oligo(dT)-柱层析法原理：真核mRNA3`端具有poly(A)利用具有Oligo(dT)-层析柱分离；四、核酸纯度鉴定方法：紫外吸收法核酸浓度测定：1OD值相当于50g/ml的双链DNA相当于40g/ml的单链DNA或RNA核酸浓度计算公式：双链DNA浓度(g/ml)=OD260×稀释倍数×50/1000单链DNA或RNA浓度(g/ml)=OD260×稀释倍数×50/1000核酸纯度测定：DNA样品：OD260/OD280≈1.8RNA样品：OD260/OD280≈1.8-2.0第二节核酸凝胶电泳电泳：带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象；+-双链DNA的电泳负极到正极：分子量由大到小根据支持物分为：一、琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳的分类电泳槽（垂直和水平）电泳仪电泳装置一、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是红色海藻产物琼脂中提取的一种多糖，加热到沸点后再冷却凝固就形成了良好的电泳介质；主要试剂：琼脂糖电泳缓冲液：TBE(Tris、硼酸、EDTA)上样缓冲液：溴酚蓝、二甲苯青、蔗糖染色剂：溴化乙锭操作：⒈选择琼脂糖种类、确定浓度(根据核酸分大小)；琼脂糖凝胶浓度(%)分离DNA的有效范围(Kb)0.35~600.61~200.70.8~100.90.5~71.20.4~61.50.2~32.00.1~2琼脂糖凝胶浓度与分离DNA的有效范围⑴加缓冲液⑵加热：90度左右⒉制胶⑶灌胶，插入梳子（冷却40-45度后凝固）；⑷将凝胶置于电泳槽中；⑸加入电泳缓冲液，拔出梳子⒊上样：样品与上样缓冲液混合，加入胶孔中；⒋接通电源，进行电泳；上样缓冲液的作用（监测电泳的进程；增加样品密度）溴酚蓝(200bp)二甲苯青(1600bp)1.4%琼脂糖凝胶⒌染色：溴化乙锭：一种荧光染料，和双链DNA结合后，在紫外光照射下发橙黄色荧光；⒍检测：紫外透射仪、凝胶呈像分析系统凝胶电泳的应用⒈核酸分子量的检测⒉鉴别分子量相同而构型不同的DNA分子⒊RNA样品质量的检测28SrRNA18SrRNA二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺和N,N`-甲叉双丙烯酰胺在TEMED和过硫酸铵的催化下聚合而成。特点：凝胶孔径较小；分辨率高（相差一个bp的DNA）；适合分离5-500bp的DNA；聚丙烯酰胺凝胶电泳分类变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离单链DNA）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离双链DNA）连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳第三节DNA测序一、Sanger双脱氧链终止法二、Maxam-Gilbert化学降解法三、DNA测序自动化一、Sanger双脱氧链终止法⒈建立体外DNA合成体系：待测序DNA标记引物DNA聚合酶4种dNTPddNTP⒉调整dNTP和ddNTP的比例，新合成的DNA链可能在任何位置加入ddNTP，导致合成终止，得到一系列长度不同的DNA片段⒊变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离合成的DNA片段⒋放射自显影读出DNA序列（和待测DNA互补）二、Maxam-Gilbert化学降解法⒈制备标记片断（四个化学降解反应体系）反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主要断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯甲基化脱G六氢吡啶GG+A甲酸脱A/G六氢吡啶G+AC+T肼C/T开环六氢吡啶C+TC肼+盐C开环六氢吡啶C⒉读序三、DNA测序自动化