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小鼠骨髓细胞微核试验和染色体畸变分析Down（唐氏）综合征患者发病率：1/800，1.25‰，以10亿人口计，1.25‰x10亿=125万。体征：智力发育不全，发育迟缓，面容呆滞，眼距宽。眼裂小，外眼角上斜，鼻根扁平，张口伸舌，流涎水缺乏抽象的思维能力，只会发单音节。常伴有四肢、五官、内脏、皮肤等方面的异常。50%患者伴有先天性心脏病，是死亡的主要原因。白血病的发病率高于常人20倍。Down综合征-为21-三体syndrome实验内容•知识点回顾•微核试验•染色体畸变分析突变诱发突变自发突变：物种进化人类健康危害新品种培育、选择、改良发生过程长，频率低发生过程短，频率高；可为人类利用，也可能对人有害遗传损伤基因突变染色体结构改变染色体数目改变机理以DNA为靶的损伤：基因突变染色体畸变不以DNA为靶的损伤染色体数目改变突变的类型突变后果观察项目的选择遗传学终点（geneticendpoint）（致突变试验的观察终点）基因突变染色体畸变染色体组畸变DNA原始损伤成套观察项目应：包括每一类型的遗传学终点包括多种物种（原核生物与真核生物）同时选择体内试验与体外试验体细胞与生殖细胞基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）、哺乳动物细胞基因突变试验染色体畸变试验：染色体分析、微核试验DNA损伤试验：姐妹染色单体交换(SCE)试验、程序外DNA合成试验化学致突变物的检测细胞分裂分为四个期：1、G1期（DNA合成前期）：RNA和蛋白质合成，为DNA复制做准备。2、S期（DNA合成期）：体细胞的DNA复制，含量加倍。3、G2期(DNA合成后期)：该期主要为M期作准备，包括复制因子的失活和有丝分裂促进因子的分化，有关细胞骨架系统重新组装的蛋白质合成。4、M期(有丝分裂期)：前期：核内的染色质凝缩成染色体，核仁解体，核膜破裂以及纺锤体开始形成。中期：中期是染色体排列到赤道板上，纺锤体完全形成时期。后期：后期是各个染色体的两条染色单体分开，分别由赤道移向细胞两极的时期。末期：为形成二子核和胞质分裂的时期。染色体分解，核仁、核膜出现，赤道板上堆积的纺锤丝，称为成膜体。细胞有丝分裂示意图第一部分：微核试验•学习和掌握小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核测定方法什么是微核？微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的细胞质内，因比主核小，故称微核。各种类型的骨髓细胞都可形成微核。来源有二：1.断片或无着丝粒染色体在分裂后期不能定向移动，从而遗留在细胞质中；2.有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞质中。什么是PCE?PCE（骨髓嗜多染红细胞）是指在红细胞成熟之前，最后一次分离后数小时将主核排出的细胞，是红细胞的某一个时期，而微核仍留在细胞质中。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低，因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。微核试验微核试验MNNCE微核标本图微核试验的运用用于检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变两种遗传学终点。三、实验器材与试剂1、仪器和器械生物显微镜、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、载玻片、纱布、滤纸、吸管、细胞计数器等。2、试剂甲醇，小牛血清（已灭活），Giemsa应用液，磷酸盐缓冲液等。四、实验步骤1、实验动物及处理（1）动物选择：一般选用大小鼠，小鼠最常用，18-22g，每组10只，雌雄各半。（2）染毒途径：根据研究目的或受试物性质不同，原则上可尽量采用人类接触受试物的途径：通常采用灌胃法和腹腔注射。（3）染毒次数：多次染毒法（每天染毒一次，连续4天，第五天取样）或间隔24h两次染毒法（处死前30h+处死前6h）（4）剂量及对照选择：据受试物的LD50，以1/2LD50为最高剂量组，下设3-4个剂量组（一般取受试物LD50的1/2、1/5、1/10、1/20等剂量），以求获得微核的剂量-反应关系曲线。同时设立阳性（环磷酰胺）和阴性对照（溶剂组）。2、骨髓涂片的制备（1）骨髓的制取：小鼠颈椎脱臼处死，打开胸腔，沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断，剥掉附着其上的肌肉，擦净血污，横向剪开胸骨，暴露骨髓腔，然后用止血钳挤出骨髓液。（2）涂片：先滴一滴小牛血清于载玻片的一端，然后将骨髓液挤入血清里，仔细混匀。一般来讲，两节胸骨髓液涂一张片子为宜。然后，按血常规涂片法涂片，长度约2cm~3cm，在空气中晾干，若立即染色，需在酒精灯火焰上方，稍微烘烤一下。（3）固定：将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min。（4）染色：将固定过的涂片放入Giemsa应用液中，染色15~20min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗。（5）透明：用滤纸及时擦干染片背面的水滴，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明5min。（6）封片：取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签。3、观察与计数先用低倍镜，后用高倍镜粗略检查，选择细胞分布均匀，细胞无损，着色适当的区域，再在油浸镜下计数。虽然不计数含微核的有核细胞，但需用有核细胞形态染色完好做好判断制片优劣的标准。本法观察含微核的嗜多染红细胞。嗜多染红细胞（PCE)呈灰蓝色，无细胞核，成熟红细胞(NCE)呈淡桔红色。微核大多数呈单个圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质相一致，呈紫红色或蓝紫色。每只动物至少计数1000个嗜多染红细胞。微核率指含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率（‰）表示之。若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上微核，仍按一个有微核细胞计数。并计算200个细胞中PCE/NCE的比值。4、结果分析及评价正常的PCE/NCE比值约为1（正常0.6～1.2），如果0.1,则表示PCE形成严重受到抑制，如果0.05，则表示受试物剂量过大，结果不可靠。微核试验数据可用二项分布、possion分布、卡方检验等统计学方法处理。涂片小窍门在载玻片1／3与2／3交界处混匀血清和骨髓液，以一端缘光滑的载片为推片，将推片一端置于骨髓液之前，并与载片形成30～45度的夹角，待骨髓液沿推片端缘扩散时，均匀而迅速适当地用力向前推成薄膜。骨髓液不宜太多或太少，两玻片间的夹角要适当，否则膜会过厚或过薄。推片时用力要均匀，一次推成，切勿中途停顿或重复推片。注意事项：1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时要涂匀，以便推片4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细胞分散度是否良好5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优良的染色流程图取胸骨，骨髓的制取涂片：先滴一滴小牛血清于载玻片的一端，然后将骨髓液挤入血清里，仔细混匀。固定：将干燥的涂片放入甲醇液中固定5min。染色：将固定过的涂片放入Giemsa应用液中min，然后用磷酸盐缓冲液冲洗透明：用滤纸及时擦干染片背面的水滴，然后放入二甲苯中透明5min。封片：取出滴上适量光学树脂胶，盖上盖玻片，写好标签动物骨髓细胞染色体畸变分析目的和意义:1、学习动物骨髓细胞染色体标本的制作2、了解动物体内染毒及染色体畸变类型染色体畸变分析：染色体结构和数目的异常改变。染色体结构异常通常包括缺失、重复、倒位、易位等；染色体数目变异包括整倍体和非整倍体变化。一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。又称为细胞遗传学实验原理染色体畸变的产生和微核的形成原理相同，观察终点不同，染色体畸变只能在细胞分裂的中期进行观察和分析。为收集足够的中期相细胞，在收获细胞前，用秋水仙碱或乙酰甲基秋水仙碱处理，以阻断微管蛋白的聚合，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使分裂间期和前期的细胞停在中期相。细胞通过低渗，使染色体均匀散开，然后固定，染色，可在油镜下观察。操作步骤一、收获细胞1秋水仙碱处理实验动物（小鼠4mg/kg处死动物前6h腹腔注射）2取股骨3PBS液5ml冲洗骨髓，1500r/min离心10min，去上清二、低渗1打散沉淀物，加入37℃预温的0.075mol/L的KCl6ml混匀，于37℃低渗15－20min2再加固定液1－2ml混匀，立即于1000r/min离心10min，去上清三、固定1使细胞悬浮，加入固定液4ml混匀，放置室温10－20min，然后1000r/min离心10min，去上清2同样方法再固定一次，去上清，留0.5ml四、制片染色使细胞悬浮，将细胞悬液滴于冰冻的载玻片上，干燥，用10％Giemsa染液染色10－20min，取出清洗自然干五、阅片先在底倍镜下选择分散良好、细胞未破裂的中期分裂相，油镜下观察并记录染色体结构异常和数目异常细胞结果分析与评价结果：以每只动物为观察单位，每只动物观察100个中期分裂相，计算其畸变细胞率分析与评价：1阴性和阳性对照组的畸变率应与所用动物的种属及有关资料相符2试验结果可以用多种统计方法处理，所得结果应该是相同的3各实验组即便细胞率与阴性对照组相比较，应该有显著性差异，还应有剂量反应关系注意事项：低渗是本实验的关键，控制好低渗时间，做出分散良好的染色体标本，关系到实验结果的准确性流程图处死小鼠，取股骨PBS液5ml冲洗骨髓，1500r/min离心10min，去上清打散沉淀物，加入37℃预温的0.075mol/L的KCl6ml混匀，于37℃低渗15－20min加固定液1－2ml混匀，1000r/min离心10min，去上清使细胞悬浮，加入固定液4ml混匀，放置室温10－20min，1000r/min离心10min，去上清同样方法再固定一次，去上清，留0.5ml使细胞悬浮，将细胞悬液滴于冰冻的载玻片上，干燥用10％Giemsa染液染色10－20min，取出清洗自然干，阅片