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目录设计思路…………………………01实验原理…………………………04实验方法…………………………05实验过程…………………………06微核展示…………………………15统计结果…………………………16结果分析…………………………20存在问题…………………………23实验总结…………………………24参考文献…………………………25实验设计思路在设计实验方案时，日常生活中的食品、用品都曾成为我们讨论的话题，不过最终我们把视线移向了亚硝酸钠（强致癌物质），进而联想到生活中可能含有亚硝酸盐的常见食品，例如腌菜、香肠等。01查阅资料得知短期腌制蔬菜(“暴腌菜”)亚硝酸盐的含量超国家标准25倍以上；亚硝酸钠作为国家食品卫生法允许使用的食品添加剂被广泛应用于肉质品(如香肠)加工中，残留超标对人体有极大危害[1]；亚硝酸钠能与各种氨基化合物(主要来自蛋白质的分解产物)反应，产生致癌的N-亚硝基化合物，它是一种很强的致癌物质；02上述信息中我们发现不论是“暴腌菜”还是香肠的安全性都主要与亚硝酸盐的含量有关，那么究竟亚硝酸盐的毒性如何？我们经常食用的腌菜、香肠是否存在安全问题？因此，我们决定利用植物微核检测亚硝酸钠的毒性以及腌菜与香肠的安全性。设想：能否通过做出亚硝酸钠致微核率的趋势线(“标准曲线”)，从而得出腌菜、香肠的亚硝酸盐含量？03微核定义：在有些情况下细胞中除了有一个正常的细胞核外，还可以看到与核着色相同、大小不等（在主核1/3以下）、完全与主核分开的圆形或椭圆形微小核，细胞学上称为微核。实验原理微核形成机理由于理化因素引起染色体断裂或干扰染色体行为使之落后，当大部分染色体到达细胞两极并重新被核膜包裹时，落后的染色体或染色体片段不能进入主核，便形成了独立于主核之外的核物质团，并在间期时浓缩成小核(微核)。04实验方法利用蚕豆根尖分生组织细胞有丝分裂形成微核的根尖微核技术05显微镜、恒温水浴锅、电炉、镊子、解剖针、烧杯、培养皿、锥形瓶、离心管、载玻片、盖玻片、吸水纸、标签纸实验前准备---器材、试剂、选材Carnoy氏固定液、70%酒精、1mol/LHCl、醋酸地衣红染液、蒸馏水NaNO2器材试剂实验过程选材烤肠、腌菜水(取自桂园食堂)蚕豆(实验室提供)06在各大数据库进行文献检索，搜集与课题有关的文献作为参考。查阅资料清洗仪器将要用到的仪器清洗干净待用。实验前准备07配制浓度为25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L[2]的亚硝酸钠溶液。称取0.0800gNaNO2溶于一定量蒸馏水中，加水至200mL。取100mL即为最高一级梯度。取原液逐级稀释得到各梯度溶液。分别贮藏备用。A亚硝酸钠梯度溶液B香肠浸提液将预备好的烤肠捣碎成泥状，转移到烧杯中，加适量水于电炉上进行加热。不断搅拌混合物，适时加水。待到搅动阻力明显减小时，过滤混合物，收集滤夜，贮藏备用。D卡诺氏固定液取95%乙醇和冰醋酸按3:1的比例配制，用时配制即可。实验前准备---配制溶液腌菜水设置为两个浓度梯度，即原浓度与1/2原浓度。C腌菜水08实验操作1.浸种催芽先在大烧杯中集体浸泡一段时间，后转出，分装到培养皿中继续浸泡。*注意换水1234092.处理CK–400mg/L香肠浸提液待蚕豆根尖长至1～2cm左右，用被检测液处理根尖，每一处理选取6～8粒初生根尖生长良好、根长一致的种子，放入盛有被检测液的培养皿中，被检测液浸泡根尖。同时，取另一培养皿以蒸馏水处理根尖，作为对照。处理时间约为6小时。实验操作103.恢复培养待处理结束后，将各组种子用蒸馏水浸洗三次，每次2～3min，再将洗净的种子放回培养皿进行恢复培养22～24小时。实验操作114.固定根尖细胞将恢复后的种子从根尖顶端切下1～2cm长的幼根，按照分组分别放入贴好标签的10ml离心管中。加入适量新配制的卡诺氏固定液，进行固定2～24小时。因为固定后镜检无法一次性完成，故先保存于70%酒精溶液中。待镜检时再取出使用。实验操作125.制片镜检将根尖从酒精中取出，用蒸馏水漂洗三次，装入离心管中加入1mol/LHCl60℃恒温水浴解离10min。取出后漂洗三次。取根尖分生组织（1-3mm）加1-2滴醋酸地衣红染液，用镊子夹碎组织并去除大的组织块，染色约5min，刚上盖玻片进行镜检。考虑到统计方便，我们采取了拍照的方式来获取数据。具体操作如下：随机选取视野中分散排列较好的区域用高分辨率相机拍下照片，并按组别命名。后在计算机上数出细胞总数和微核细胞数。进行后续处理。实验操作13实验流程记录14微核展示25mg/LCK25#50#200#100#400#烤肠#（黑色标示为图片来源梯度，箭头所示为滞后染色体及微核）15统计结果各组微核率统计如下：表一对照组16表二25mg/L亚硝酸钠处理组表三50mg/L亚硝酸钠处理组17表四100mg/L亚硝酸钠处理组表五200mg/L亚硝酸钠处理组18表六400mg/L亚硝酸钠处理组表七烤肠浸提液处理组19结果分析从统计结果可以看出：亚硝酸钠浓度在25～400mg/L范围内，致蚕豆根尖分生组织区微核率是逐渐上升的，污染程度逐步加深；表八各组微核率与污染指数不同浓度下培养所得蚕豆根尖的微核率(‰)0.005.0010.0015.0020.0025.00050100150200250300350400450亚硝酸钠浓度(mg/L)微核率(‰)使用微核率和污染指数来反映各组被检测液的污染程度，发现两套指标的所反映的情况并不一致，但是污染程度的趋势是一致的；20ANOVAMCN平方和df均方F显著性组间905.5625181.11215.387.000组内211.8721811.771总数1117.43423表九单因素方差分析单因素方差分析显示亚硝酸钠各处理组的微核率差异极显著（表九），即不同浓度亚硝酸钠的处理效应差异极显著；表七、表八反映烤肠浸提液对蚕豆根尖是没有毒害作用的，间接地说明实验所用烤肠对人体的安全性是没有问题的；以上各表中并没有反映腌菜水处理根尖的结果，主要是因为设计的浓度梯度都偏高，导致蚕豆根尖出现不同程度的脱水，进而使得酸解效果极差，在制片时组织也很难夹碎，观察到的细胞都由于机械损伤而破碎；21实验中我们发现之前设想的答案是否定的(能否通过做出亚硝酸钠致微核率的趋势线(“标准曲线”)，从而得出腌菜、香肠的亚硝酸盐含量？),因为腌菜水和烤肠浸提液的成分是复杂的，并非只含有亚硝酸盐，尽管它可能是最主要的毒害物，但是我们的实验设计没有考虑到这方面，还需要进一步的研究分析。22存在的问题实验中反映出以下几个问题，与大家共同思考1.微核的辨别问题，即怎样更准确地识别微核？2.取样的随机性问题，即如何更具代表性地取样使得微核实验数据的可信度提高？3.处理时间的问题，即如何确定处理时间的长短？23实验总结团队合作很重要；敢于面对问题和麻烦，学会思考；要坚持，要耐心；24参考文献【1】梁鹏、马俪珍、王艳梅.添加物对香肠中亚硝酸钠残留量的影响.肉类工业.2007【2】王虹、王小娟、高向丽.亚硫酸钠和亚硝酸钠对蚕豆根尖细胞致突变作用的研究.癌变畸变突变.2009【3】钱晓薇.蚕豆根尖细胞微核实验方法的改进.温州师范学院学报.199825【4】季守莲，钮荣祥，宋正蕊.蚕豆根尖微核技术检测实验室化学毒物的致突变性.中国职业医学.2003谢谢观看2012/12/13微核实验汇报