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第六章分子生物学基本研究法（下）——基因功能研究技术6.1基因表达研究技术6.2基因敲除技术6.3蛋白质及DNA相互作用技术6.4基因芯片及数据分析6.5其它分子生物学技术6.1基因表达研究技术6.1.1基因表达系列分析技术（SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE）是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。图6-1常规SAGE方法（shortSAGE）基本流程又叫接头，末端有氨基，防止5‘端相连锚定酶，即限制性内切酶SchematicofSAGEmethod:锚定酶识别4个碱基。分离3’端酶解片段并将其分为两份，分别与连接子1和连接子2（均含有IIS类标签酶的识别位点）结合，用标签酶（一种Ⅱ类限制酶，它能在距离识别位点数个或十数个碱基的位置切割DNA双链）如BsmF1酶切，将含有连接子1和2的样品混合后测序分析。LongSAGE技术ShortSAGE技术用14个碱基的标签代表一个基因，不能覆盖大基因组（如人类）内所有的基因序列。LongSAGE技术所用标签来自转录物3’端一段21bp的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与ShortSAGE方法类似，只是用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程序做了相应修改。6.1.2RNA的选择性剪接技术RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。包括：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。图6-2选择性剪切的不同类型图6-4果蝇（Drosophilamelanogaster）的Dscam基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的mRNA异构体6.1.3原位杂交技术原位杂交(InSituHybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。mRNA的互补链，杂交信号集中于纤维细胞中。负对照，mRNA的同义链,无杂交信号。正对照，UBQ10杂交信号遍布于整个胚珠。ExpressionpatternofBARD1InSituhybridizationHanP,LiQ,ZhuYX.(2008)MutationintheArabidopsisBARD1BRCTDomainReleasesWUSCHELExpressionfromtheOrganizingCenter.ThePlantCell20:1482-1493.荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH).对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。人肌糖原磷酸酶基因在11号染色体的定位结果。6.1.4基因定点突变(site-directedmutagenesis).通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。图6-6寡核苷酸介导的DNA突变技术目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。重叠延伸诱变法示意图图6-8大引物诱变法示意图6.2基因敲除技术6.2.1基本原理经典遗传学（Forwardgenetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学（Reversegenetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除（geneknock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。图6-9用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验图6-10正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞正向选择基因neo通常被插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。负向选择基因HSV-tk则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可能被整合到基因组中，导致细胞死亡。6.2.2高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。图6-12模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术策略与应用。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。6.2.3植物基因敲除技术T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。图6-14植物基因敲除及突变体筛选a.引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。b，PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。Identifiationofbard1-3homozygouslines6.3蛋白质及DNA相互作用技术6.3.1酵母单杂交系统（Yeastone-hybridsystem）是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。将顺式作用元件与最基本启动子（minimalpromoter，Pmin）相连并将报告基因连到Pmin下游，将待测转录因子cDNA与酵母转录激活结构域（transcription-activatingdomain,AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就激活Pmin启动子，报告基因表达。图6-15酵母单杂交的基本原理示意图图6-16从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子示意图。将不同基因或基因片段分别克隆到pYF503中(GAL4AD为GAL4激活结构域,emptyvector表示无基因克隆到pYF503中),转入酵母中表达N端带有GAL4DNA结合结构域的融合蛋白，观察报告基因表达与否。Identificationoftrans-activationpropertyofQRAP2byyeastone-hybridassay.PlasmidDNAfromvariousconstructswastransformedintoyeastcellsandtheabilitiesoftranscriptionactivationoftherecombinantproteinwasidentifiedviablue/whiteselection.Nobluecolorwasobservedinyeastcellstransformedwitheither•theemptyvector(containsonlytheGAL4DNA-bindingdomain)•afull-lengthUBQ10gene•theC-terminus(fromaminoacid113-292)ofQRAP2ligatedtotheGAL4DNA-bindingdomain.6.3.2酵母双杂交系统（Yeasttwo-hybridsystem）真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（bindingdomain，BD）和转录激活结构域（activationdomain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。图6-17酵母双杂交技术原理示意图6.3.3体外蛋白质相互作用技术1、FarWestern印迹技术用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。图6-18FarWestern印迹试验2、GST融合蛋白沉降技术利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。图6-19GST融合蛋白沉降技术流程。3、蛋白质芯片技术蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。GongW.etal.(2008)MolecularPlant1:27-41.4、等离子表面共振技术将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。图6-21等离子表面共振技术示意图5、免疫共沉淀技术(Co-IP)将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。免疫共沉淀示意图6.3.4细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET）FRET荧光能量转移有三个基本条件：（1）给体与受体在合适的距离（1～10nm）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）；（3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。图6-23荧光共振能量转移法FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。常用的探针有：荧光蛋白传统有机染料镧系染料荧光蛋白，一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。镧系染料，金属染料。一般与有机染料联用，分别作为FRET的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比。6.3.5RNAi（RNAinterference,RNA干涉）技术及其应用RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的论文。RNAi作用机制示意图。研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA,single-s