第五章 微生物生长及其影响因素

第四节微生物独特的合成代谢所谓合成代谢，是指微生物利用能量将简单的无机或有机的小分子前体物质同化成高分子或细胞结构物质；合成代谢时，必须具备三个条件，那就是代谢能量、小分子前体物质和还原基,只有具备了这三个基本条件，合成代谢才能进行。微生物的合成代谢，有其独特的代谢途径，但多数代谢过程与高等生物相同或类似，如蛋白质的合成、核算的合成。由于微生物蛋白质的合成和核酸的合成基本同一般生物的生化过程，限于篇幅，这里主要要求对微生物独特的肽聚糖的生物合成代谢途径有所了解。细胞壁肽聚糖的合成过程是一个极其复杂的过程，根据反应进行的部位不同，整个合成过程可分为在细胞质中、在细胞膜上和在细胞膜外3个阶段。（1）在细胞质中合成①由葡萄糖合成N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸；②由N-乙酰胞壁酸合成“P”核苷酸（见书P123，图3-8）（2）在细胞膜中合成是由“P”核苷酸合成肽聚糖亚单位的过程，分为5步反应（见书P123，图3-9）（3）在细胞膜外合成被运送到膜外的肽聚糖亚单位以细胞壁残余（至少6~8个肽聚糖亚单位）作引物，之间发生转糖基作用，使多糖横向延伸一个双糖单位，再通过转肽作用，使2条多糖链间形成甘氨酸五肽而发生纵向交联反应（见书P125，图3-10）第四节微生物独特的合成代谢青霉素抑制转肽作用的机制青霉素是肽聚糖亚单位五肽末端的D-丙氨酰胺-D-丙氨酸的结构类似物，两者竞争转肽酶的活性中心，从而竞争性抑制了肽聚糖的转肽作用，使肽聚糖分子不能发生纵向交联反应而形成细胞壁层。（见书P125，图3-10）青霉素的抑菌作用只针对生长态的细菌第四节微生物独特的合成代谢青霉菌落对周围细菌的抑菌作用第五章微生物的生长及其影响因素第一节微生物生长一、微生物生长的概念一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按其自身的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其重量、体积、密度或浓度作指标来衡量。所以：个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖二、微生物生长量的测定（一）稀释平板菌落计数法是一种最常用的活菌计数法。（二）血球计数板法这种方法的特点是测定简便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性，只适合于个体较大的微生物种类，如酵母菌、霉菌的孢子等；此外测定结果是微生物个体的总数（三）称干重这种方法较适合于丝状微生物的生长量的测定，对于细菌来说，一般在实验室或生产实践中较少使用。（四）比浊法微生物生长曲线把一定微生物接种到一定量的液体培养基中，在一定条件下进行一次性培养，定时取样测定活菌数，以活菌数的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可以画出一条有规律的曲线，这就是微生物的典型生长曲线（growthcurve）。一般把典型生长曲线划分为适应期、对数增长期（指数期）、稳定期和衰亡期等四个时期。该生长曲线只适用于单细胞微生物，包括细菌和酵母菌。活菌数的对数(一)适应期（adaptivephase）适应期的出现，可能是因为在接种到新鲜培养液的细胞中，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢物。该时期有几个特点：①生长繁殖的速度几乎等于零。②细胞形态增大；③细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性。④合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。⑤对外界不良条件反应敏感。影响适应期长短的因素很多，除菌种外，主要有三。1．菌种的菌龄菌龄即“种子”(inoculum)的群体生长年龄，亦即它处在生长曲线上的哪一个阶段。2．接种量接种量的大小明显影响适应期的长短。3．培养基成分活菌数的对数适应期对数增长期稳定期衰亡期（二）对数增长期(logarithmicphase)又称为指数增长期（exponentialphase），是指在生长曲线中，紧接着适应期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。对数增长期有以下几个特点：①生长繁殖的速度很快，世代时间均匀一致；②酶系活跃，代谢旺盛。③菌细胞的形态特征均匀一致，最代表种的特征；④此时期内的微生物的生化特性均匀一致，并且典型。稳定期（stationaryphase）稳定期到来的原因主要是：①营养物尤其是生长限制因子的耗尽；②营养物的比例失调，例如C/N比值不合适等；③酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；④pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜等等。在稳定期时，细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物。在此时期内主要表现为：（1）细胞内开始积累贮藏物，如肝糖颗粒、异染颗粒、脂肪颗粒等（2）大多数能形成芽孢的细菌在此时期内形成芽孢；（3）在此时期内，细胞的次级代谢产物大量积累，菌细胞的总数也达到最高峰。如何延长稳定期，促进代谢产物的积累，对稳定期到来的原因进行研究，还促进了连续培养技术的设计和研究。衰亡期（declinephase或deathphase）在衰亡期中，个体死亡的速度超过新生的速度，因此，整个群体就呈现出负生长(R为负值)。在这个时期内，细胞形态出现不正常，呈多样性，细胞种的特征典型生理生化出现异常现象，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶(autolysis)，芽孢释放往往也发生在这一时期。在衰亡期，菌细胞很容易发生变异微生物的连续培养连续培养(continuousculture)连续培养是在研究生长曲线的基础上,当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流加新鲜培养基，并立即搅拌均匀，另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。这样，培养物就达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上其优点：①高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；②自控，便于利用各种仪表进行自动控制；③产品质量较稳定；④节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。第三节环境因素对微生物生长的影响一、温度每种微生物都有自己的生长温度三基点：最低生长温度:最适生长温度:最高生长温度:在生长温度三基点内，微生物都能生长，但生长速率不一样。微生物只有处于最适生长温度时，生长速度才最快，代时最短。一般情况下，每种微生物的生长温度三基点是恒定的，但也常受其它环境条件的影响而发生变化。最低温度最适温度最高温度嗜热液化芽孢杆菌376070嗜热纤维芽孢杆菌506068丙酮丁醇梭菌203747植物乳杆菌103040干酪乳杆菌103040大肠杆菌103747乳脂链球菌103037嗜热链球菌2040~5053枯草杆菌1530~3755黑曲霉730~3947啤酒酵母102840根据微生物最适生长温度的不同，可将它们分为三个类型。1．嗜低温微生物（psychrophiles）多数在零度条件下能够生长,一般最适生长温度在10～15℃，最高生长温度为20℃；2．嗜中温微生物（mesophiles）这类微生物的最适生长温度一般在20～45℃之间。在这一类中又可分为室温型微生物和体温型微生物。前者多数是腐生型微生物,它们的最适生长温度一般为20～28℃；人和温血动物的寄生菌属于体温性微生物，它们的最适生长温度与其宿主体温接近，在37～45℃之间。3.嗜高温微生物（thermophiles）能在45℃以上生长的微生物均属这一大类。它们常存在于温泉、堆肥中，土壤中也有高温菌。在发酵工业中，如果能找到好热菌作为菌种，可以缩短生产周期，防止杂菌污染。热对微生物的致死作用（1）热（力致）死温度（thermaldeathtime，TDT）是指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间。（2）D值（decimalreductiontime）是指在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90%的活菌被杀死）时所需时间（min）（3）Z值是指在加热致死曲线中时间降低一个对数周期（即缩短90%的加热时间）所需升高的温度（℃）（4）F值是指在一定的基质中，其温度为121.1℃，加热杀死一定数量微生物所需是时间（min）第三节环境因素对微生物生长的影响热灭菌法（1）干热灭菌法火焰灭菌法；干热灭菌法（2）湿热灭菌法煮沸消毒法：100℃，15min以上；巴氏灭菌法：60~85℃，15~30min；超高温瞬时灭菌法（UHT）：135~137℃，3~5s；高压蒸汽灭菌法：121.1℃，15~30min；115℃，30min；间歇灭菌法：100℃，30min，28~37℃培养过夜，反复3次第三节环境因素对微生物生长的影响二、干燥对微生物生长的影响1．水分活性值的概念Aw值是指在密闭容器内含有水溶性物质的蒸汽压与相同条件下纯水蒸汽压的比值。以纯水的蒸汽压为P0，水溶性物质的蒸汽压为P，则Aw=P/P0。不含任何固形物成分的纯水的P=P0，即Aw=1；绝对不含水分的物品的P=0，即Aw=0，因此Aw值最大为1，最小为0。所以Aw值在0与1之间。一些微生物主要类群的最低水分活度(AW)第三节环境因素对微生物生长的影响微生物最低Aw值微生物最低Aw值一般细菌0．90嗜盐细菌0．75一般酵母菌0．88干生性霉菌0．65一般霉菌0．80耐渗透压酵母菌0．60三、渗透压对微生物生长的影响等渗环境：正常生长高渗环境：质壁分离，不能生长甚至死亡低渗环境：细胞膨胀甚至破裂致死食品工业中常用高浓度的盐或糖保存食品第三节环境因素对微生物生长的影响四、辐射对微生物生长的影响可见光、红外线、紫外线、χ-射线、γ-射线均具有杀菌作用紫外线的杀菌机理紫外线穿透能力差，因此常用于食品工业中厂房内空气及物体表面消毒，也可用于饮用水的消毒；适量的紫外线照射，可作为诱变育种的工具第三节环境因素对微生物生长的影响五、pH对微生物生长的影响不同的微生物都有最适生长pH值和一定的pH值范围微生物在代谢过程中会改变环境的pH，原因一是糖类和脂肪代谢产酸；二是蛋白质代谢产碱在发酵工业中及时调整发酵液的pH值，有利于积累代谢产物食品工业中常用的酸类防腐剂有苯甲酸或苯甲酸钠、山梨酸或山梨酸钾盐（山梨酸钠盐）、丙酸及其钙或钠盐、脱氢醋酸及其钠盐和乳酸第三节环境因素对微生物生长的影响六、氧气对微生物生长的影响1．需氧微生物（aerobe）绝大多数丝状真菌、放线菌和部分细菌属于这个类型。2．厌氧微生物（anaerobe）主要是一些细菌属于这一类群，如梭状芽孢杆菌属（Clostridium）、产甲烷杆菌属（Matharobacterium）等。3．兼性需氧微生物（facultativeaerobe）绝大多数酵母菌和部分细菌属于这种类型。4．微量需氧微生物（microaerophilic）只有少数细菌属于此类型，如拟杆菌属（Bacteriodes）中的个别种。5．耐氧性厌氧微生物（aerotolerantanaerobe）主要是一些乳酸菌属于该呼吸类型。第三节环境因素对微生物生长的影响七、超声波对微生物生长的影响频率：≥20000Hz，引起微生物细胞破裂，内含物溢出而死病毒和细菌芽孢具有较强的抗性，特别是芽孢第三节环境因素对微生物生长的影响八、化学消毒剂重金属盐类对微生物都有毒害作用，可使蛋白质变性或沉淀，但对人有毒害作用，故严禁用于食品工业中防腐或消毒有机化合物：酚（石炭酸）及其衍生物可使蛋白质变性，具表面活性剂作用，破坏细胞膜通透性而致死，低浓度抑菌，高浓度杀菌，常用2~5%进行医院环境消毒，不适用于食品工业；醇类是脱水剂、蛋白质变性剂，也是脂溶剂，可损害细胞膜而具杀菌能力，常用70%乙醇消毒；甲醛可与蛋白质的氨基结合使之变性致死，0.1~0.2%甲醛液可杀死细菌繁殖体，5%可杀死芽孢，可作为熏蒸消毒剂