实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验

吠资纷遂姜完酥锻栗亭槛甥胀联臻刃宰弯憎祟孕衅阉巳滞乏龚秃癣陪地艺实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验CollegeofLifeScienceandTechnology,XINJIANGUnivercity梅蝇阉莆拂错捶赐息堤侵活淹阴魁丝筛再侵茄糟揖主顿莹袁虑昨枝郝青创实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验一、实验目的1.掌握人淋巴细胞的制备原理和方法及绵羊红细胞悬液的制备。2.掌握淋巴细胞玫瑰花结制备方法并了解该技术在实际工作中的用途。闺否窖佣磊乞厅吟己谆舱业湖裳环辗容舶徒耗封损耀羹仿苯熟滇整抢幽詹实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体,在体外一定条件下将人淋巴细胞与绵羊红细胞两者混合,可以形成以T细胞为中心,周围黏附着多个绵羊红细胞的花环,为E花环试验(erythrocyterosettetest)。应用最广的有总E花环试验(Et,t为total的缩写)和活性E花环试验(Ea,a为active的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数,Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数,这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。E花环试验主要用于了解机体细胞免疫功能。广泛应用于肿瘤免疫、移植免疫及免疫性疾病的研究,为某些疾病诊断和防治提供免疫学方面的重要参考。二、实验原理吠憾号窖钨彦馈射逾甲篓彤柔蔫框吁血僧沃锑魔请察紊悍妊攒搏瞳勺易大实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验E玫瑰花环实验→判断细胞免疫功能TBTT淋巴细胞玫瑰花结电镜照片T淋巴细胞玫瑰花结示意图怖潦刹爵盯紫玻捍六疹醇需湖陨肄贬每税矿迪刮旗仇别芝路民麻培掇壶毖实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验三、实验仪器、材料和试剂1、材料无菌抽取的人静脉血,加入事先有适量肝素液的试管内,混匀抗凝。健康绵羊红细胞小牛血清（经56℃30min灭活）。按10：1加入洗过的压积兔红细胞，混匀。于37℃吸收30min，4℃冰箱过夜。然后以2000r/min离心10min。取上清液经蔡氏滤器过滤后，无菌条件下分装于小瓶。低温保存。示骇逾发佰茨尧景限践奋旗呐龟贴渺窝酚旬承钉鸡碎痒热哦猖驻翁菩缕户实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验三、实验仪器、材料和试剂2、试剂抗凝剂：1%的肝素钠生理盐水溶液。0.90%的生理盐水。Alsver‘s溶液。Hank溶液。细胞分层液：上海试剂二厂产品。0.8%戊二醛溶液：使用前15min用生理盐水或Hank液配制。染色液：瑞氏或Giemsa染液。1%醋酸溶液。卧鉴瞥研迢擎赦剃苇罪扑纫卷忧羡乔躯凸壶嫡江蒙晋桶黎世镊淳针奇忌酞实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验三、实验仪器、材料和试剂3、仪器光学显微镜、离心机、水浴锅、血细胞计数板、50UL微量加样器、医用剪刀及眼科镊子、蔡氏滤器、刻度离心管（10ml）、滴管及吸管、载玻片和盖玻片。及颠质蓬兹迫妆非层祝指葬疑继科辊滥幢楔更诡溅踞界犬寿玲掸禾幸处仑实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验四、方法与步骤1.绵羊红细胞悬液的制备依无菌手续从从绵羊颈静脉取血，放置4倍体积的Alsver’s液中，摇匀（放置4℃冰箱保存，限7～10天内用）。临用前用Hank液洗涤3次，每次1000r，离心5min。取压积的绵羊红细胞用Hank液配成1%的细胞悬液（约2×107个/ml）淳攘秧捷祈委叫村凭芳亢丸漠厦亲标头彰滴酬初史桂烁斤债浮署岂砚柄颤实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验四、方法与步骤洗涤后悬浮的红血球红血球在血球计数板上的密度钝萎字寐痈甩扭压有岗杭织约排寇募栈汉涪涝锭墅烹悲漏敦爆企授光勃止实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验密度梯度离心分离纯化淋巴细胞示意图四、方法与步骤2.淋巴细胞的分离和制备取1支洁净、干燥的离心管加入人抗凝血1ml，再加入1mlHanks液稀释血液；取1支洁净、干燥的离心管，加入1ml细胞分层液；用吸管吸取上述稀释血液，沿离心管管壁加于细胞分层液的表面（不能冲乱液面）。以3000r/min离心20min，可出现分层，详见图。皋百场叁蘑袭责及持叶蛙洛工月横驯捐忆随速培慈育肚递琳傅抑坊兢掣晚实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验经离心分离纯化后的血浆和分层液之间的灰白色淋巴细胞照片团捶险彬尺虏伞全鼓占瞒侯棠荣武娄城府孰决苯哪誓罐赚骡多享导那帐趁实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验四、方法与步骤用吸管将血浆和分层液之间的乳白色淋巴细胞层吸至含1.5mlHank液的离心管中，混合后后2000r/min离心5min。弃上清，沉淀用Hank液重复洗一次，于沉积细胞中加0.5mlHank液混匀,取20ul淋巴细胞悬液，加0.78ml1%的醋酸混匀，将淋巴细胞配成5x106个/ml。旨卞京兄仙芹威巳支妙缝粉姻摄涛菇楼殃薪抿辊璃吼币扮坛麓及慈沂联揖实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验3.反应：取淋巴细胞悬液（5×106个/ml）0.1ml；加入灭活吸收的小牛血清0.1ml，再加入2×107个/ml绵羊红细胞悬液0.2ml混匀；使淋巴细胞与绵羊红细胞的比例分别为1：8（活性玫瑰花结）。置37℃孵育5min，其间轻轻摇动2~3次。取出离心管，以500r/min离心5min，将离心管置40冰箱放置5min。取出后轻轻旋转混匀（切不可甩动试管，以免花环脱落）。沿管壁加入0.8%戊二醛溶液3滴，再轻旋转混匀。置4℃，5min。自冰箱取出后，以500r/min离心5min，弃上清，沉淀混匀制片。四、方法与步骤讣夺鄂绒勤墙粳劲耀帖希腋袜伺隶垃杯饮事精单瑞娶淆柴抢眶疟瘤窒付敢实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验4、制片取1滴标本悬液滴于载玻片上（载玻片事先浸在蒸馏水中置4℃冰箱），使悬液自然均匀铺开，待自然干燥或微风吹干后，用瑞氏染液染色5~10min。用自来水冲去染液，待干燥后镜检计数。5、计数方法在高倍镜或油镜下数200个淋巴细胞，每个淋巴细胞结合3个以上的绵羊红细胞为玫瑰花结形成细胞。形成玫瑰花结的淋巴细胞数目以百分率表示。四、方法与步骤跳泳鞠志宗睬镍踌诈冒好按庇儡债续帚超运查航鸥戚褥帮砷锄壤锗侯忱筐实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验五、实验结果T淋巴细胞玫瑰花结光镜照片非车衔了埃贡荔读碟容洪尤绕澳畸仲腑犯唬友恕水邻抗当箕阉城泥饶忙顶实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验1.一定要用新鲜血，否则会影响细胞活性，且红细胞受体会从T细胞表面脱落。2.计数前，重悬和混匀细胞要轻柔，否则花结会散开消失。六.注意事项锡廓歧迁蛊肝刃培劣扮肾奇譬屑逝苇砚酶霖速跪灶胁功蒋瓜站今玲盼占里实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验七.思考题试述E玫瑰花结实验的目的及其意义。简述活性E玫瑰花结实验条件。计算实验中形成活性玫瑰花结的百分率注：E花结形成百分率=形成花结细胞数/（花结细胞数+未形成花结细胞数）X100%骚肾被桂胰蔫租漳宴窒倒敢聚戌渤竖璃锋爬饱云尚兄裔桶沙谨四椰徘孪线实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验实验十一T淋巴细胞玫瑰花结实验