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第四模块生物显微制片技术生物显微制片技术根据材料的性质和制作法的不同，生物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类：•切片法：徒手切片法；石蜡切片法；火棉胶切片法；冰冻切片法等。•非切片法：包括整体封藏法；涂布法；压片法等。本模块主要介绍石蜡切片法、冰冻切片法。石蜡切片法石蜡切片法是利用石蜡作为组织支撑物，对组织标本进行切片和染色观察的制片方法从取材开始，到制成切片标本为止，其间必须经过以下各主要步骤：一、取材二、固定三、洗涤四、脱水五、透明六、透入与包埋七、切片八、贴片九、染色十、封藏实验十七石蜡切片法（一）取材、固定、洗涤、脱水、透明、透蜡、包埋一、实验目的1.理解取材、固定、洗涤、脱水等各步骤的基本原理。2.了解取材、固定、洗涤、脱水等各步骤的注意事项。3.掌握取材、固定、洗涤、脱水等各步骤的操作方法。1.取材：用于制片的动植物材料应选择新鲜的，用陈腐材料制片，往往不能反映材料的真正情况。2.固定：固定是借助化学药品的作用,使细胞组织的形态保存下来,不使其改变形态和变质。二、实验原理固定液的特点与作用(1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。(2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。(3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。(4)使细胞内的成分凝固或沉淀。(5)使组织变硬，具有一定的硬度。(6)固定以后能起到保存的作用甲醛固定的原理1.甲醛通过与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白多肽分子间形成亚甲基桥(-CH2-)，蛋白质不再发生改变，保存原位。2.醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，分子间交联形成的网络结构可能部分和完全遮盖抗原决定簇，使之不能完全暴露1.取材的注意事项：材料应新鲜；动作要迅速；取病理材料时，应加对照。2.固定的注意事项固定液以新配为好；固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定；材料固定完毕，保存于加盖的容器，贴上标签。3.洗涤：洗涤是洗去渗入细胞内部的固定液。因材料中的固定液有的会妨碍染色；有的会发生沉淀或结晶，影响观察；有的会继续作用，使材料变坏等。3.洗涤的注意事项洗涤的时间要依固定剂的种类而定；固定液为酒精或酒精混合液，一般不冲洗；含有铬酸、重铬酸钾等，必须用流水冲洗；长时间固定于福尔马林的应充分水洗。3．洗涤：材料自固定液中取出，放入指形管，加入半管水，用纱布将管口扎紧，置于水槽内，进行流水冲洗。流水冲洗时间一般需要12-24小时。4.脱水：材料经洗涤后含有大量的水分，必须用脱水剂脱尽里面的水分，以利于材料的透明和制片的保存。因为水分会使材料分解，而且透明剂与水是不相混合的，只有在完全无水的情况下，透明剂才能完全透入。4．脱水：材料自低浓度至高浓度的酒精进行脱水。一般经50%、70%、85%、95%直至纯酒精。每级停留约30分钟至1小时。如需过夜，应停留在70%酒精中。4.脱水的注意事项脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分；在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏；在低浓度酒精中，每级停留时间不宜太长，防止材料解体；在高浓度酒精中，每级停留的时间也不宜太长，防止材料变脆；脱水必须彻底，否则不易透明。二、实验原理1.透明是指利用透明剂既可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质，将脱水剂替换出来，使石蜡能顺利进入材料中。2.透蜡是指将材料中的透明剂逐步清除，以至完全由石蜡充分渗透。1.透明的注意事项(1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中水分进入；(2)更换透明剂，动作要迅速；(3)材料周围出现白色雾状，应退回纯酒精中重新脱水。2.透蜡的注意事项(1)动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料为54-60ºC。(2)透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；3.包埋是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡一起倒入一定形状的容器内，并立即投入冷水中，使它凝固成含材料的蜡块，以备切片。3．包埋：从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，用温镊子夹取材料平放于纸盒底部，使之排列整齐。将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆的水面，待石蜡的表面凝固，将纸盒慢慢浸入水中，待石蜡完全凝固（约30分钟）后即可取出备用。附：生物组织包埋机操作方法（演示）。包埋机3.包埋的注意事项(1)包埋前应先把必需的用具（恒温箱、温台、纸盒）准备好。(2)包埋用的镊子要先放在温箱中预热。实验流程：1.脱水：85%酒精（30分钟）—95%酒精（30分钟）—100%酒精（30分钟）。2.透明：1/2纯酒精+1/2二甲苯（20分钟）——纯二甲苯中（15—30分钟，至透明为止）。3.透蜡：材料透明后移入1/2二甲苯+1/2石蜡等量的混合液中(30分钟)，然后进入纯石蜡Ⅰ中约40—60分钟，再换纯石蜡Ⅱ中约40—60分钟(此部分操作在温箱中进行)。4.包埋：纯石蜡注入包埋用纸盒中，取蜡杯，用温镊子夹取材料平放于纸盒底部，使之排列整齐。将纸盒慢慢地平放在面盆的水面，待石蜡的表面凝固后即可取出备用。实验十九石蜡切片法（三）—切片、贴片一、实验目的1.掌握切片、贴片的操作方法。2.了解切片、贴片过程中应注意事项。二、实验原理切片是把包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带。肝细胞（hepatocyte）体积较大，直径20～30μm，贴片是用粘贴剂把切片平铺贴在载玻片上，以便于染色。常用的黏附剂有APES(3-Aminopropyl-Triethoxysilane3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷)、多聚-L-赖氨酸(Poly-L-Lysine)、明胶、甘油蛋清等三、实验步骤（一）切片切片前的准备工作（1）石蜡块的固着：先将蜡块用刀片切成方形或长方形，组织四周留下2—3mm宽的石蜡。点燃酒精灯，然后用烤热的蜡铲放在台木和蜡块之间，利用蜡铲的温度熔化两者的蜡，把蜡块粘附在台木上。（2）整修：用单面刀片将蜡块四周修整平行。2.切片机一般常用的为轮转式切片机，这种切片机的夹物部分是上下移动，前后推进的，而夹刀部分则固定不动。通过调整控制刀片厚度的微动装置就可以切出不同厚度的连续切片。3．切片的方法（1）将已固定修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。（2）将护刀盖推至打开位置。（3）摇动快速进退手轮，使石蜡块与刀口贴近，但不超过刀口。（注意：在转动手轮时，应保证机头在红、绿线之间移动。）（4）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15-30度。（已调好）（5）调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般4-10微米。（6）一切调整好后就可以切片。此时右手摇动大手轮，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度以每分钟40-50转为宜。（7）切成的蜡带到20-30厘米时，右手用另一支毛笔将蜡带挑起，平放在蜡带盘上。（注意：靠刀面的一面较光滑朝下）。（二）贴片1．取一清洁的载玻片，滴一小滴（10uL）粘片剂于玻片中央，用手指涂抹均匀，晾干。2．用刀片割一小段蜡带，放在水浴锅水面上，使其伸展。用载玻片斜插入水中，缓慢靠近蜡带，使其贴在玻片上，慢慢取出。3.把玻片标本置于展片台上（温度保持在40-45ºC），直到蜡片伸展摊平。5．展片后把玻片标本编好记号，放在平盘上。四、注意事项1.要严格按照操作程序进行切片。2.切片刀刀口锋利，应用时切忌手指触及刀口,并且防止切片刀跌落桌上或地面，以免发生刀伤事故。3.切片机工作完毕，应将大手轮处于锁紧状态，此时机头在最上端，将护刀盖推至合并位置。4.及时清除废蜡，保持设备清洁。选交8片玻片标本（6片肝组织切片，2片小肠组织切片）。实验二十石蜡切片法（四）染色、封藏一、实验目的1.理解染色、封藏的基本原理。2.了解染色、封藏的过程中应注意的事项。3.掌握染色、封藏的操作方法。二、实验原理1.染色：细胞和组织的不同结构之所以能被染成各种不同的颜色，是由于染料对它们所起的物理与化学综合作用的结果。(1)物理作用：如渗透作用、吸收作用、吸附作用等。(2)化学作用：疏水键、离子键、氢键等。以常用的苏木精-伊红对染法为例：细胞核内含有酸性物质，易与碱性染料苏木精中有染色作用的阳离子结合，细胞核被染上蓝色。细胞质含有碱性物质，易与酸性染料伊红中有染色作用的阴离子结合，细胞质被伊红染上粉红色。2．封藏：封藏是使已经透明的材料保存在适合折光率的封藏剂中，使材料能在显微镜下清晰的显示出来，并能长期保存。三、实验程序1.染色的一般方法由于要染的切片包在石蜡之中，而所用的染色剂又常常为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水，石蜡切片在二甲苯中溶去石蜡，经过各级酒精，下降至水，经染色后需再脱水，上升到二甲苯透明然后封藏。苏木精——伊红（简称H.E）对染法(1)二甲苯脱蜡10min。(2)二甲苯与纯酒精等量混液5min。(3)纯酒精，95%、85%、70%、50%酒精各3min。(4)蒸馏水1min。(5)埃利希氏苏木精染色液7min。(6)流水冲洗5min。0.5～1％盐酸酒精（70％酒精配制）分色20S。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止（7）流水冲洗5分钟，或者在1%稀氨水或碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化（20s），细胞核呈蓝色。(7)1%伊红水溶液5min。(8)50%酒精数秒。(9)70%、80%、95%、纯酒精各3min。(10)纯酒精与二甲苯等量混合液5min。(11)二甲苯5min。(12)封藏:封藏于中性树胶中。2.封藏的方法在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地放下，避免产生气泡。四、实验结果细胞核染成蓝色、细胞质染成粉红色。鼠肝组织切片（H.E染色）鼠小肠组织切片（H.E染色）五、作业1.简述石蜡切片的基本原理与方法六、思考题1.在石蜡切片操作过程中容易出现哪些不正常现象？应如何解决？