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血清谷丙转氨酶活性的测定一、实验目的1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。二、基本原理血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸反应生成谷氨酸和丙酮酸：生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中ALT的活性。*仪器1.5×15cm试管、刻度吸量管。2.恒温水浴、离心机、721型分光光度计。*试剂1.0.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液⑴0.1mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO414.22g或Na2HPO4·2H2O17.8g溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml,4℃保存。⑵0.1mol/L磷酸二氢钾溶液：称KH2PO413.61g溶解dH2O中，稀释至1000ml,4℃保存。⑶将0.1mol/L磷酸氢二钠溶液420ml和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液80ml混和即为0.1mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液。加氯仿数滴，4℃保存。三、仪器与试剂2.标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/mL）取标准丙酮酸钠10mg，用上述缓冲液准确定容为50mL。此液须当日用当日配。3.ALT底物液(含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml)取α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸7g,用试剂1溶成100ml，在稀释到刻度前，以1mol/LNaOH调pH至7.4（因为转氨酶在pH7.3以下或7.6以上的环境中酶活性下降），加数滴氯仿防腐。此液于冰箱保存可使用4天。4.2.4二硝基苯肼溶液取分析纯2,4二硝基苯肼19.8mg，用1mol/LHCl溶于100ml，置棕色瓶中保存。5.0.4mol/LNaOH溶液常规配制。1、血清样品制备取鸡血100mL于4oC静置10hr，后经离心分离得到血清，保存于冰箱中待用(由于血细胞中转氨酶活性较血清中高，故应防止溶血；若血清中此酶活性过高，则可适当稀释后再用)。2、标准曲线制作取6支干燥洁净的试管，按下表操作，得出实验结果。以吸光度值为纵坐标，酶活力单位数为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。四、实验操作3、血清样品谷丙转氨酶活性的测定取4支干燥洁净试管，按下表操作（血清和底物溶液事先保温10min）：五、实验结果1、将得出的吸光值在标准曲线上查得酶活性2、计算：丙酮酸物质的量（μmol）SGPT活性单位/100mL=×1000时间（min）1.在测定SGPT时，应事先将底物、血清在37℃水浴中保温，然后在血清管中加入底物，准确记时。2.标准曲线上数值在20~500U是准确可靠的，超过500U时，需将样品稀释。3.转氨酶只能作用于α－L－氨基酸，对D－氨基酸无作用。实验室多用α－DL－氨基酸（较L－氨基酸价廉），若用L－氨基酸，则用量减半。4.溶血标本不宜使用，因血细胞中转氨酶活力较高，会影响测定效果。5.血清样品的测定需在显色后30分钟内完成。六、注意事项6.丙酮酸标准液的浓度要求十分精确。由于丙酮酸开封后易变质为多聚丙酮酸，而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不易察觉。建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液。7.每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过0.015A，若有超出，应仔细检查试剂与仪器方面的问题。8.严重脂血、黄疸、溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本可增加测定的吸光度，测定这类标本应做血清标本对照管9.操作中加0.4NNaOH液时，需以较慢速度加入，并且边加边摇匀加快时则a一戊酮二酸引起的发色增强。10.本实验中各试剂加量都需要准确，并且要注意控制条件，保温时间要严格.11.本法测定SGTP正常值为40单位以下。*1个卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。*国际单位：在最适温度（25℃）下，1分钟产生1μmol丙酮酸的酶量为1个活性单位，即1IU=1umol/min。*King法单位定义是：每1ml血清在37℃条件下与底物作用60min，生成1μmol丙酮酸称为一个单位。*Mohun法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37℃条件下与底物作用30min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。七、酶活性单位的定义六、临床意义化验介绍:正常时，谷－丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所以血清中此酶活力很低。当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。临床意义:谷－丙转氨酶的增高意义较大，其增高程度可反映肝细胞损害和坏死的程度。（1）肝胆疾病：急性病毒性肝炎，ALT是最为敏感的指标之一，会出现明显升高。慢性肝炎血清ALT升高一般不超过参考值的3倍，而且有时可降至正常。慢性活动性肝炎血清ALT可升高至参考值的3－5倍以上。活动型进行性肝硬化时ALT可中轻度升高，但在代偿期可正常或稍增高。患原发性肝癌时，ALT可正常或中轻度升高。胆道疾病如胆石症引起梗阻时，虽无肝细胞病变，但ALT可稍升高。（2）其他疾病：心肌梗塞及心功能不全导致肝淤血可使ALT明显升高。骨骼疾病、多发性肌炎、肌营养不良均可使ALT活性升高。某些药物或毒物如异菸肼、鲁米娜、四氯化碳等可引起ALT活性升高。参考值:速率法：0－30IU/L【思考题】1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？3.分析实验误差产生的原因