7蛋白质的分离与纯化

CollegeofLifeScience1蛋白质的酸碱性质2蛋白质分子的大小与形状3蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀4蛋白质分离纯化的一般原则5*蛋白质分离纯化的方法6蛋白质含量的测定与纯度鉴定一、蛋白质的酸碱性质蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。二、蛋白质的大小与形状π:渗透压R:气体常数T：绝对温度c:溶质的浓度（g/m3）π/c对c作图，在c趋近于零时得出Mr菲克第二定律扩散不仅与蛋白质的分子量有关，还与分子形状有关由于浓度差异引起的溶质分子的净迁移成为平衡迁移或者迁移。菲克第一定律22dxcdDdtdcdxdcDAdtdmDtxxecc4122122离心机类别低速离心机高速离心机超速离心机①离心力“F”当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即：a-粒子旋转的加速度，m-沉降粒子的有效质量，ω-粒子旋转的角速度，r-粒子的旋转半径(cm)。rmamF2②相对离心力“RCF”相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g”（980cm/sec2）,“RCF”相对离心力可用下式计算：RCF=1.119×10－5×(rpm)2r9802rRCFω＝602rpmπω＝(rpm—revolutionsperminute每分钟转数，r/min)③离心机转速与离心力列线计算图一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g”表示。在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”.转速与离心力的换算:先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。超离心法类别1#密度梯度离心法（densitygradient）2*沉降速度法（sedimentationvelocity）3*沉降平衡法（sedimentationeguilibrium）密度梯度离心法#生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。蔗糖密度梯度蔗糖浓度离心管颗粒物质或溶质在超速离心场中的沉降速率。用小写斜体s表示。s=v/a，其中a为重力或离心加速度，v为沉降速度，即沉降系数为每单位离心力场的沉降速度。)()1()(22122212xxvccRTdInMr在较低速度（8,000-20,000r/min）的离心场中，离心开始时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度。因而产生了扩散作用，扩散力的作用方向正与离心力相反，当净离心力与扩散平衡时，在离心池内从液面到池低形成一个由低到高的恒定浓度梯度。如果测得相关参数即可算出生物分子的分子量。离心力x1轴心液面离心轴扩散力x2原理示意图Vt：柱床“总容积”，Vo：即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积。Vg：凝胶本身的容积；Vt＝Vo十Vi十Vg或Vt-Vo=Vi十Vg，凝胶床总体积分配系数（Kd）0＜Kd＜1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化Ve：为实际测得的洗脱容积，自样品加入到组分最大浓度(峰)出现时所流出的容积ViVoVeKd)(Ve＝Vo十KdViVe=K1-K2lgMK1、K2为常数，Ve可用如下表达式代替，Ve-Vo（分离体积），Ve/Vo（相对保留体积），Ve/Vt（简化洗脱体积），Keff（相对洗脱体积）在不同型号凝胶上蛋白质的选择曲线的差异Ve与相对分子量的关系排阻范围的选择凝胶装柱①将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧；②向柱中加入约1/3体积的0.9％NaCl溶液；③将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液；④凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。④连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。（防止空气进入凝胶床）柱层析系统的安装凝胶层析中的分离行为蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾(黄色)电泳蛋白质的沉淀使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有：1.盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。2.有机溶剂沉淀法：在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。3.重金属盐沉淀（条件：pH稍大于pI为宜）：在蛋白质溶液中加入重金属盐溶液，会使蛋白质沉淀。重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。4.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI）生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。“柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。5.弱酸或弱碱沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。弱酸或弱碱沉淀法机理：破坏蛋白质表面净电荷。分离纯化蛋白质的一般原则研究蛋白质的结构与功能：要求纯度高，不变性；提取活性的酶或蛋白质：必须保持天然活性状态；作为药物或食品添加剂：纯度要求一般。蛋白质分离纯化的一般步骤材料的选择→原料的预处理→蛋白质的抽提→从抽提液中沉淀蛋白质→纯化→蛋白质的结晶1.原料的选择：要求含待分离的蛋白质丰富，廉价，易得，容易收集，新鲜无腐败。2.原料的预处理：如果待分离蛋白质为胞外蛋白质，材料破碎后，用适当的溶剂直接抽提；若待分离蛋白质为胞内蛋白质，则需要破碎细胞膜，再用适当的溶剂抽提。3.从抽提液中沉淀蛋白质：常用盐析法、低温乙醇沉淀法、等电点沉淀法。4.纯化：将沉淀的蛋白质溶解，再选择适当的纯化方法，得到纯度比较高的蛋白质溶液。纯化方法：透析或超滤、电泳法、凝胶过滤法、离子交换层析、吸附层析法、超速离心法等。5.蛋白质的结晶：从溶液中重新沉淀蛋白质。五蛋白质分离纯化的方法（一）据分子量大小不同的方法1透析与超滤利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。为了避免被膜截留的蛋白质在膜表面上堆积，现常用截向流过滤的方法，即液体在泵驱动下沿着与膜表面相切方向流动，在膜上形成压力，使部分液体透过膜，而另一部分液体切向地流过表面将被膜截留的蛋白质分子冲走。滤膜抽气滤膜离心2密度梯度离心3凝胶过滤以上两种方法既可以用来测定蛋白质的分子量，又可以用来分离蛋白质（二）利用溶解度的差别1等电点沉淀2盐溶与盐析蛋白质溶解度与离子强度的关系无机盐的种类及选择Ks取决于盐的性质，与离子价数成正比，与离子半径和溶液介电常数成反比。常见阴离子的盐析作用顺序：PO43-＞SO42-＞CHCOO-＞Cl-＞N03-＞Cl04-＞I-＞SCN-阳离子的盐析作用顺序为NH4+＞K+＞Na+＞Mg2+盐类必须溶解度大、受温度影响小，而且盐溶液密度不高。饱和溶液调整的计算V:需要加入饱和硫酸铵溶液的体积V0:原溶液的体积S1,S2:分别为原溶液和所需达到的硫酸铵饱和度固体直接加入的计算W：将一升S1提高到S2时需加入的硫酸铵克数G和A为常数，受温度影响有机溶剂用量的计算V=V0(S2-S1)/(100-S2)V＝需加入有机溶剂的体积；V0＝蛋白溶液的原始体积；Sl＝蛋白溶液中有机溶剂的浓度；S2＝蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度。3、温度和pH对有机溶剂沉淀的影响有机溶剂沉淀时应注意的问题低温下操作中性盐的盐溶作用可减少变性多价阳离子可降低蛋白质的溶解度防止过量有机溶剂引起共沉淀沉淀应尽快分离，并溶于缓冲液中热沉淀根据蛋白质间的热稳定性的差别进行蛋白质的热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。热沉淀是一种变性分离法，带有一定的冒险性，使用时需对目标产物和共存杂蛋白的热稳定性有充分的了解。（三）根据电荷不同的纯化方法1电泳电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gelelectrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starchgel）、琼脂糖凝胶（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。电泳技术分类毛细管电泳电泳支持物滤纸凝胶薄膜2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,简称PAGE)，也称圆盘凝胶电泳或圆盘电泳(discgelelectrophoresis)，它是在区带电泳的基础上发展起来的。它以聚丙烯Ift胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分是分离胶），这二部分凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度,pH以及电场强度都是不同的，即不连续的。这样,电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带（厚度约为0.1mm），然后再进行电泳分离。PAG是用丙烯酰胺(acrylamide，Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N，N-methylen。bisacrylamide，Bis)在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。化学聚合:催化剂过硫酸铵(AP)，加速剂TEMED光聚合:催化剂核黄素，加速剂TEMED不连续PAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应3毛细管电泳毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（2-75μm）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。4.等电聚焦（isoelectricfocusing）原理:在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴