电泳

电泳技术及临床应用济宁医学院附属医院检验科胡树恒电泳技术及临床应用一、概述（generalization)电泳（electrophoresis）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（electrophoresistechnique）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（electrophoresister）。电泳技术及临床应用目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等。电泳技术及临床应用第一节电泳原理第二节常用电泳技术和电泳方法第三节常用电泳设备的基本结构及技术指标第四节电泳仪的临床应用第五节电泳技术的质量控制第一节电泳原理一、电泳的基本原理物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。第一节电泳原理二、影响电泳的外界因素（一）电场强度（二）溶液的pH值（三）溶液的离子强度（四）电渗作用（五）粒子的迁移率（六）吸附作用第二节常用电泳技术和电泳方法一、电泳技术的分类（一）根据工作原理的不同：可分为移界电泳、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳等。（二）根据有无固体支持物可分为：自由电泳和支持物电泳第二节常用电泳技术和电泳方法（三）根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直电泳、板状电泳、柱状电泳、U型管电泳、倒V字形电泳、毛细管电泳等。（四）根据支持物的特点又可分为：①无阻滞支持物电泳。②高密度的凝胶电泳。（五）根据电源控制的不同，一般可分为以下3类：1.恒压电泳;2.恒流电泳;3.恒功率电泳。第二节常用电泳技术和电泳方法（六）根据自动化程度的不同，可分为半自动和全自动型。（七）根据其功能的不同，可分为制备型、分析型、转移型、浓缩型等。（八）根据用法的类型可分为：双向电泳、交叉电泳、连续纸电泳、电泳－层析相结合技术等。（九）根据不同的使用目的可分为：核酸电泳、血清蛋白电泳、制备电泳、DNA测序电泳等。第二节常用电泳技术和电泳方法二、电泳方法简介（一）纸电泳指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V～1000V）进行电泳。平卧式电泳槽装置示意图第二节常用电泳技术和电泳方法（二）醋酸纤维素薄膜电泳电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。血清蛋白的电泳图谱第二节常用电泳技术和电泳方法（二）醋酸纤维素薄膜电泳1.肝脏疾病：血清白蛋白减少与γ球蛋白增加是肝病患者血清蛋白电泳的共同特征其减少与增加的程度与肝实质损伤程度相关。①肝炎：急性肝炎早期或病变较轻时，电泳结果可无异常或前白蛋白减少。但随病情加重和时间延长，电泳图形可改变，白蛋白α及β球蛋白减少，γ-球蛋白增高传染性肝炎患者血清白蛋白轻度下降，α2球蛋白增高并伴有γ球蛋白增高；因为受损肝细胞作为自身抗原刺激淋巴系统，使γ-球蛋白增生，急性肝坏死时，白蛋白明显下降，球蛋白显著升高，出现A/G比值的倒置提示肝功能损伤到一定程度。第二节常用电泳技术和电泳方法（二）醋酸纤维素薄膜电泳②肝硬化：血清蛋白电泳可有明显的变化，白蛋白中度或高度减少，α1、α2和β球蛋白百分比也有降低倾向，γ-球蛋白明显增加，并可出现β-γ桥，即从β区到γ区连成一片难以分开，或两区间仅见一浅凹。如同时有α1α2-球蛋白减少，首先要考虑肝硬化。β-γ桥出现的原因系由IgAMG同时增加，而IgA和IgM在电泳上位于β区和γ区之间所致。肝硬化时常有多克隆免疫球蛋白升高特别当IgA明显升高时便使β区与γ区融合一片出现了β-γ桥。③肝癌：此类患者血清蛋白电泳均有改变α1、α2-球蛋白明显增高有时可见于白蛋白和α1-球蛋白的区带之间出现一条甲胎蛋白区带，具有诊断意义。第二节常用电泳技术和电泳方法（二）醋酸纤维素薄膜电泳2.肾脏疾病：如肾病综合症时,由于尿中排出大量白蛋白而使血清中自蛋白明显下降,α2及β-球蛋白升高,γ-球蛋白减少或正常；急性肾炎时α2球蛋白可增高,有时合并γ球蛋白轻度增高；慢性肾炎可见γ-球蛋白中度升高。3.多发性骨髓瘤和M蛋白血症如华氏巨球蛋白血症，良性单克隆免疫球蛋白增生症时血清β、γ区带处出现一特殊单克隆区带，称为M蛋白质，血清总蛋白增高。4.结缔组织病：系统性红斑狼疮风湿性关节炎等自身免疫性患者可有不同程度的白蛋白下降及γ-球蛋白升高。第二节常用电泳技术和电泳方法（三）凝胶电泳由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。它具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小(1～100μg）、分辨率高等优点。凝胶电泳图第二节常用电泳技术和电泳方法（四）等电聚焦电泳1．等电聚焦电泳过程一种利用有pH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH值梯度的凝胶介质中，在电场内经过一段时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH值位置上，最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带净电荷与PH的关系曲线第二节常用电泳技术和电泳方法2．等电聚焦电泳的特点①使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度；②由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；③电泳速度快;④分辨率高;⑤加入样品的位置可任意选择；⑥可用于测定蛋白质类物质的等电点;⑦适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。第二节常用电泳技术和电泳方法（五）等速电泳采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分离等速电泳示意图第二节常用电泳技术和电泳方法（六）双向凝胶电泳（二维电泳）第一向采用等电聚焦根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状。第二节常用电泳技术和电泳方法胶性PH9中电加解入质了溶双液PH3加上电场后建立稳定PH梯度蛋白质溶液加入，建立电场染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开第一向等电聚焦PI逐渐降低等电聚焦胶放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶上第二向SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量逐渐降低PI逐渐降低双向凝胶电泳示意图第二节常用电泳技术和电泳方法(七）免疫电泳免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。第三节常用电泳设备的基本结构及技术指标一、常用电泳设备的基本结构（一）电泳电源（二）电泳槽（三）附加装置平卧式电泳槽装置示意图第三节常用电泳设备的基本结构及技术指标二、电泳仪的主要技术指标1．输出电压8．连续工作时间2．输出电流9．保护措施3．输出功率10．显示方式4．电压稳定度11．定时方式5．电流稳定度12．电源电压6．功率稳定度13．电源频率7．输出组数14．功耗第四节电泳仪的临床应用一、血清蛋白电泳新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后，通常可见5条带，即清蛋白、1、2、和球蛋白。许多疾病总血清蛋白浓度和各蛋白组分的比例有所改变，通过血清蛋白电泳图谱能帮助我们对某些疾病进行诊断及鉴别诊断。血清蛋白电泳图谱第四节电泳仪的临床应用二、尿蛋白电泳临床进行尿蛋白电泳的主要目的是：①确定尿蛋白的来源；②了解肾脏病变的严重程度（选择性蛋白尿与非选择性蛋白尿），从而有助于诊断和预后的判断。当不能进行肾活检时，尿蛋白电泳结果能很好地协助临床判断肾脏的主要损害。尿蛋白电泳图谱第四节电泳仪的临床应用三、血红蛋白及糖化血红蛋白电泳应用电泳法鉴别患者血液中Hb的类型及含量，对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。Hb电泳结果应根据不同年龄人群进行分析。谢谢