电泳分析法 金叶

电泳分析法金叶11807-1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗粒的电迁移现象，并开始研究带电粒子在电场中的电迁移行为，测定它们的迁移速度。电泳的发展1907年，Field和Teague研究出填充有琼脂糖凝胶的桥管，成功地分离了白喉毒素和它的抗体。09:38:4321937年，蒂塞利乌斯（Tiselius，瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定。第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖。09:38:4331959年，Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持电解质，创造了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了区带电泳的分辨率。09:38:434一、定义及原理1、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。2、原理电泳技术就是利用在电场作用下，根据待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。3、应用：电泳技术除了用于小分子物质(无机盐、氨基酸、核苷酸、脂类)的分离分析外，最主要用于生物大分子(蛋白质、核酸、酶)的研究。以生物大分子为例阐明电荷来源R╱╲COOHNH3+R╱╲COO-NH3+R╱╲COO-NH2+OH-+H++OH-+H+pHpIpH=pIpHpI2000年版药典包括5种电泳技术:纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳2005年版药典增加毛细管电泳法二、电泳分类（一）按有无固体支持物分类按有无固体支持物可以分为两类：自由界面电泳和支持物电泳。1、自由界面电泳即溶质在自由溶液中泳动，包括：等电聚焦电泳、等速电泳等。2、支持物电泳根据所用的支持物不同又可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、根据支持载体的位置或形状可分成：水平电泳、垂直板式电泳、垂直柱式电泳、U型管电泳、毛细管电泳等。1、自由界面电泳2、区带电泳3、高效毛细管电泳（二）按分离原理分类自由界面电泳：在没有惰性支持物的液体接界面上进行的电泳。缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难区带电泳：是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动的电泳方法。避免对流的干扰。纸电泳醋酸纤维素电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA序列分析电泳槽中型双垂直电泳槽实验室常见的电泳装置水平电泳（核酸电泳）垂直电泳（蛋白质电泳）1、区带电泳基本理论在众多电泳技术中，最常用的为区带电泳，同时也是最简洁的电泳模式。推动离子/粒子作区带电泳的驱动力为电场力（F），离子/粒子所受电场力的大小与离子/粒子的净电荷（Q）和电场强度（E）呈正比关系，即：FQE而离子/粒子在运动时会受到一定的溶液阻力（F’），对于球形离子/粒子，此阻力服从Stoke’定律，即在上式中，r为离子/粒子的半径，η为溶液或介质的黏度，v为粒子运动速度。F'=6πrηv当电泳达到稳态时，电动力等于介质的阻力，即F=F’。因此，我们得到v/E表示迁移率，也称淌度，以U表示带电粒子的电泳淌度在一定条件下取决于粒子本身的性质，即与其所带电量成正比；与其半径及介质粘度成反比。QE=6πrηvv/E=Q/6πrηU=v/E=Q/6πrη电泳淌度电泳淌度(ElectrophoreticMobility)是单位场强下离子的平均电泳速度。因为电泳速度与外加电场强度有关，所以，在电泳中常用淌度而不用速度来描述荷电离子的电泳行为和特性。U=v/E=Q/6πrη影响电泳迁移率的因素(必考)：1、影响电泳迁移率的外界因素：电场强度溶液的pH值溶液的离子强度电渗现象溶液的温度和黏度分子筛效应2.影响电泳迁移率的内在因素：质点所带净电荷的量质点的大小和形状指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。平卧式电泳槽装置示意图将滤纸条水平地架设在两个装有缓冲溶液的容器之间，样品点于滤纸中央。当滤纸条被缓冲液润湿后，再盖上绝缘密封罩，即可由电泳电源输入直流电压（100V～1000V）进行电泳。（一）纸电泳醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持介质。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜（celluloseacetatemembrane，简称CAM）。(二)醋酸纤维素薄膜电泳优点：精确性高。快速省时。一般电泳45-60min即可。灵敏度高，样品用量少。应用面广。如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。有利于扫描定量及长期保存。缺点：分离效果不太好。优缺点醋酸纤维素薄膜电泳示意图（1）预处理膜的准备：根据分离样品的多少将醋酸纤维薄膜裁切成合适的大小，在膜片无光泽的一面上用铅笔轻轻划一条加样线。加样线可选在距膜片一端2～3cm处，有时也可选在膜片的中央线附近。膜片浸透：在一浅碟或培养皿中倒入所选择的缓冲液，将膜片小心地浮铺在缓冲液面上，将膜片的的无光泽面朝下。膜片的底面吸收电极缓冲液后逐渐下沉，直至电极缓冲液将膜片完全浸透。膜片在电极缓冲液完全浸透后，用钝头镊子取出，稍稍用滤纸吸去多余的缓冲液，然后将膜片夹在两层滤纸之间吸干多余的缓冲液，但不能吸得过干而出现不透明的白色部分。实验操作步骤用铅笔在薄膜无光泽面一端2cm处画一细线，加样时平稳地前后或左右来回移动加样器，于细线处加样。毛细管、微量吸管、微量注射器或印模都可以用来加样。线型加样醋酸纤维膜上的样品线条宽度不应超过4mm，样品线与膜片上边边缘之间的距离一般为3~5mm。样品的加样量或加样体积随样品的浓度、染色和检测方法等条件的不同而有较大的变化。（2）加样（3）电泳电泳前，先用钝头镊子将加过样的膜片安放在电泳槽的支架上，膜片两端约0.5~1.0cm的部分应与支架的顶面紧贴，膜面尽可能不与手指直接接触，以免膜面受到污染。如果在同一电泳槽内同时安放几张膜片，应避免相邻膜片之间彼此接触。在电泳槽的两个电极室内注入适量的电极缓冲液，用3~4层滤纸作盐桥。膜片的两端分别用滤纸盐桥盖住，以此将膜片拉平固定并使电流通过。盖上电泳槽盖，让膜片在电泳槽内水平静置平衡10分钟，然后将电泳槽的两个电极与直流电源的正负极分别相接。架膜加盖接导线，开机染色剂要求：不应溶解醋酸纤维薄膜一般蛋白质的染色方法氨基黑10B染色：酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。丽春红S方法：是一种水溶性的阴离子重氮染料，带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合，也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合，显示红色蛋白条带。用3%三氯醋酸配制0.2%丽春红S溶液，将干燥的膜片浸入此染色剂中。染色时间不需要严格控制，但一般染色10分钟比较合适。（4）染色（5）漂洗/脱色将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无色。（6）干燥和透明干燥：避免膜片发生卷曲。常用的方法是将膜片夹在两张滤纸之间，通过滤纸来吸除膜片上多余的液体，然后取出膜片重新夹在两张滤纸之间，并用合适的平面重物平压，直至膜片完全干燥平整为止。为了长期保存和进行光吸收扫描测定，需要对膜片进行透明化处理。方法是将干燥的膜片浸入透明液中10~20分钟，然后取出平贴于玻璃板上或夹在两块大小合适的玻璃板之间，干后即为透明的薄膜图谱，可以进行扫描测定。（6）定量测定定量测定的方法有洗脱法和光密度法。洗脱法是将确定的样品区带剪下，用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的物质含量。醋酸纤维薄膜电泳应用范围较广，可用于检测和分析血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸以及其他生物大分子物质。由于醋酸纤维薄膜电泳法快速且简便，目前在医学和临床生物化学等领域已成为一种常规技术。应用人血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳⒈原理：以醋酸纤维薄膜为支持物，在pH=8.6的巴比妥缓冲液中，人血清蛋白的pI均小于8.6，带负电荷，电泳时向正极移动。由于迁移率不同而被分离。蛋白质名称等电点迁移率分子量清蛋白4.885.9×10-569000α1-球蛋白5.065.1×10-5200000α2-球蛋白5.064.1×10-5300000β-球蛋白5.122.8×10-59000～150000γ-球蛋白6.85～7.501.0×10-5156000～300000人血清蛋白质的等电点和迁移率概念：以琼脂糖凝胶作支持体的电泳方式。(三)琼脂糖凝胶电泳天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。琼脂糖（agarose）琼脂胶（agaropectin）天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖(约占80%)及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：(1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。琼脂糖凝胶电泳的缺点：(1)机械强度差，易破碎，浓度不能太低。(2)易被细菌污染，不易保存，临用前配制。(3)琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。(4)与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1μg蛋白质就可检出。(四)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由丙稀酰胺（acrylamide，简称Acr）和亚甲基双丙稀酰胺(N，N’-methylenebisacrylamide，简称Bis)聚合而成的，具有一定的网状结构。在形成凝胶的化学聚合过程中，可以人为控制聚合成具有一定大小孔径的凝胶。在电泳过程中，净电荷相近的物质在通过凝胶孔洞时，所受到的阻力和样品分子的大小和形状密切相关，即分子筛作用。原理电泳不仅能分离含有各种大分子物质的混合物，而且可以研究生物大分子的特性。诸如如电荷、分子量、等电点以至于构象。在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，属于非解离电泳。在电泳过程中仍然保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性，因而根据其电泳迁移率，可得到天然蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳——原理PAGE的特点1.具有分子筛效应，分辨率高2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明6.网孔可调节。聚丙烯酰胺凝胶胶体的制备示范PAGE垂直板式电泳PAGE应用范围较广，可用于脱辅基蛋白的分离、cDNA合成产物的分离、DNA片断的分离制备、DNA顺序分析、生物大分子分子量的测定、及RNA序列分析等。应用例1：玉米改良单交种的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。不同玉米种子清蛋白的聚丙烯酰