电泳技术

电泳技术一、概述电泳——带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis)。19世纪初(1808)发现了电泳现象。当时多用于胶体化学的分析。1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白呈4-5高峰即界面电泳。1948年Wieland等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化。近30年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置亦得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术。（一）电泳的分类：显微电泳自由界面电泳区带电泳1、按其支持物的物理性状不同可分为：(1)滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、乙酸纤维膜、聚胺纤维薄膜。(2)凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。(3)粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。(4)线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。2、按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：(1)平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。(2)垂直板式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。(3)垂直柱式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。2、按pH的连续性不同，区带电泳可分为：(1)连续pH电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。(2)非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳，等电聚焦电泳等。(二）应用：1、分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2、分析某种物质的纯度及分子量3、电泳技术与层析法结合可用于物质的结构分析4、免疫电泳可提高对蛋白质的鉴别能力二、电泳原理（一）电泳的基本原理设一带电分子在电场所受的力为F则：F=QX球形分子运动是受的阻力F’为：F’=6πγηV当F=F’时，QX=6πγηV移项：VQX6πγη=(1)V/X为带电分子在单位电场强度下的运动速度。———迁移率、电泳速度（V）在具体实验中：V=d/t电场强度：X=E/IV=X6πγηVQ=(2)V=Vd/tdIXE/IEt==某物质A在电场中移动的距离：dA=VA·Et/I某物质B在电场中移动的距离：dB=VB·Et/I两物质移动距离差为：∆d=(dA-dB)=(VA-VB)Et/I(3)若VA≠VB则∆d=0两者不能分离若VA≠VB则∆d≠0两者能分离(二)影响电泳的因素：1、电泳介质的pH值：溶液的pH值决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，pH值离pI越远，则颗粒净电荷越多，泳动速度越快，反之则越慢。因此应选择合适的pH，使各种蛋白质所带电荷差异较大，有利于彼此分开，为了使电泳过程溶液pH值恒定，必须采用具有一定缓冲能力的缓冲溶液。2、缓冲液的离子强度：离子强度影响颗粒的电动电势。溶液的离子强度越高，电动电势越小，则电泳速度越慢，反之，则越快。一般最适的离子强度在0.02～0.2之间。离子强度的计算：I=1／2ΣCiZi(I=离子强度，Ci=离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数)。离子强度过低，溶液的缓冲能力减弱，不易维持所需pH值，反而会影响颗粒带电荷状态影响电泳。3、电场强度：电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强度越高，电泳速度越快，但随着电压的增加，电流加大，产生热效应，易使蛋白质变性而改变性质影响电泳。进行高压电泳应配备冷却水系统以便在电泳过程中降温。4、电渗现象液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋+-液相固相电渗流电渗示意图血清蛋白乙酸纤维薄膜电泳[目的]熟悉乙酸纤薄膜电泳方法及其在分离血清蛋白中的应用。[原理]蛋白质是兼性离子。由于组成蛋白质分子的氨基酸种类和数目不同，各种血清蛋白质的分子量和等电点也不相同。故在同一条件下，它们电泳速度各不相同，因而可以分离。本实验以乙酸纤薄膜为支持物，利用血清中蛋白质颗粒的等电点大部分低于7，在pH8.6的缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动，电泳后根据血清蛋白移动快慢，可依次分为清蛋白、球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带，染色后显出清晰色带。乙酸纤维薄膜电泳的优点：简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等。乙酸纤维薄膜电泳的应用：目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。[操作]（一）准备：1、取缓冲液中浸泡的薄膜1张。2、用滤纸吸干多余水分。3、识别出无光泽面。4、在角上用铅笔做上记号。（二）点样：用点样器蘸上一层血清，于膜的无光泽面（距膜边端1.5厘米处点样），使血清全部渗入膜内。（+）（-）1.5cm(三)电泳：1、将膜点样面向下，两端拉紧贴于电泳槽架的纱布垫上，点样端在阴极，盖上槽盖。2、电压110-120v，40-50分钟。3、关闭电源。(四)染色：1、取出膜条，浸入氨基黑10B染色液中，染色2-5分钟。2、取出薄膜，立即浸入漂洗液中，漂洗3-4次至背景无色为止。血清脂蛋白琼脂糖电泳[原理]血清脂蛋白经苏丹黑B染色后，以琼脂糖为载体，在pH8.6巴比妥缓冲液中进行电泳，可将脂蛋白分成不同的区带。按电泳移动的速度不同，正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从阴极到阳极依次为β－脂蛋白(最深)、前β－脂蛋白(最浅)，α－脂蛋白(比前β－脂蛋白略深些)。α－脂蛋白前β－脂蛋白β－脂蛋白