细菌耐药机制(huishi)

细菌耐药机制研究进展浙江大学医学院附属第一医院俞云松AntibioticinteractionswithgramnegativeorganismsAntibioticinteractionswithgramnegativeorganismspenicillinbindingproteinspenicillinbindingproteinsOmpFOmpFOmpCOmpCCephalosporinsCephalosporinsslowerdiffusionduetoslowerdiffusionduetobulkandionicchargesbulkandionicchargesImipenemImipenemRapiddiffusionduetosmallsizeRapiddiffusionduetosmallsizeandzwitterionicandzwitterionic+/-charge)+/-charge)PBP3PBP3PBP2PBP2PBP1aPBP1aPB1bPB1bBetaLactamases(hydrolyzingenzymes)CBD/RR一、外膜孔蛋白减少或丢失•细胞内抗生素浓度降低–膜孔蛋白(OprD):细胞外膜上的某些特殊蛋白是一种非特异性的、跨越细胞膜的水溶性物质扩散通道。膜孔蛋白革兰阴性细菌细胞膜某些细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药物不能进入菌体内部，称为“内在性耐药”或“固有性耐药”（intrinsicallyresistant），即这种耐药并非是由于任何染色体的突变或是耐药质粒的获得所致。如铜绿假单胞菌的细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所具有的典型的高渗透性孔蛋白，它的孔蛋白通道对小分子物质的渗透速度仅为典型孔蛋白通道的1%。“先天不足”一些具有高渗透性外膜且对抗菌药物敏感的细菌可以通过降低外膜的渗透性而发展成为耐药菌，即原有的孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细菌就会对该抗菌药物产生很高的耐药性。亚胺培南是一种非典型的β-内酰胺类抗菌药物，主要是通过一个特殊的孔蛋白通道OprD2的扩散进入细菌的，一旦这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。“后天获得”产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌PFGE图C1C2:亚胺培南敏感C3C4:亚胺培南耐药亚胺培南敏感及耐药的产气肠杆菌SDS图C1C2:亚胺培南敏感C3C4:亚胺培南耐药PCR扩增Omp36全长及序列分析IS90398%（约1000bp)插入序列引起OprD2缺失（铜绿）ISPa1328约2000bpOprD2细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内的抗菌药物，使之到达靶位之前失去活性细菌产生的灭活酶主要有：β-内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶氯霉素乙酰转移酶MLS钝化酶二、产生灭活酶超广谱-内酰胺酶（ESBLs）高产AmpC酶碳青霉烯酶最主要的耐药因素对-内酰胺抗生素造成威胁-内酰胺酶临床上最重要的-内酰胺酶是质粒介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨基β-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类β-内酰胺酶。ESBLs在分子生物学分类中属于A类酶，在Bush分类中属于2be类酶。超广谱-内酰胺酶（extended-spectrum-lactamases，ESBLs）ESBLs的分类根据基因同源性不同分为：–TEM型80–SHV型46–CTX-M型37–OXA型18–其它型20组CTX-M-2组CTX-M-8组CTX-M-9组北京浙江新疆郑州基因型ECKPECKPECKPECKP合计CTX-M-14237763295372209CTX-M-3161661385257CTX-M-245598229CTX-M-22268CTX-M-933CTX-M-281113CTX-M-1311CTX-M-2711CTX-M-2911SHV-12311510SHV-51214SHV-222CTX-M-14+CTX-M-224134416CTX-M-14+CTX-M-322CTX-M-14+SHV-12134CTX-M-3+SHV-1211CTX-M-9+SHV-1211CTX-M-22+SHV-1211CTX-M-24+SHV-1211CTX-M-14+CTX-M-22+SHV-1211CTX-M-14+CTX-M-22+SHV-1211未检出ESBLs基因型7814689144合计5543109614226586400中国400株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因型分布32家医院1994-2003年大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产ESBLs百分率0102030405060701994199519961998199920002001200220032004年份百分比大肠杆菌肺炎克雷伯菌头孢菌素酶大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导的AmpC酶。阴沟肠杆菌ACT-1,DHA-1,CMY(Peking)DHA-1,CIT,ACT-1(Shanghai)DHA-1(Zhejiang)DHA-1,ACT-1(GuangZhou)DHA-1isThePredominantTypeinChinaMapofChina克隆片段PCR产物1100bp共6432bpORF1ORF2ORF3ORF4ORF5ORF6IS26orf-1DHA-1ampRqacE⊿1sul15232bp指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类β内酰胺酶分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。碳青霉烯酶•天然来源碳青霉烯酶–嗜麦芽寡养单胞菌的L1酶•获得性碳青霉烯酶（Ambler分子分类）–B类酶（金属酶）：IMP、VIM类及SPM-1–A类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等–D类酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其来源可分为金属酶•染色体编码的金属酶：BCⅡ，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多来源于环境寄生菌。•获得性金属酶：IMPVIMSPMGIM-1SIM-1，位于可转移的基因元件上，造成区域性传播。IMP型金属酶•IMP型金属酶GenBank上已公布21种，比较它们相互之间的序列表明：IMP型金属酶大致可以分为两组：1）IMP-1、IMP3-7、IMP9－11、IMP-162）IMP-2和IMP-8、12、13、19、20中国•IMP-42001年香港鲍曼2001年广州杨格枸橼酸杆菌、铜绿•IMP-12004年12月江苏无锡铜绿•IMP-82001台湾铜绿VIM型金属酶•VIM型金属酶与IMP类金属酶同源性40％，但两类金属酶的动力学性质相似，编码基因都位于整合子上。目前VIM型金属酶GenBank上已公布12种，比较它们相互之间的序列可将VIM金属酶大致分为三组：1）VIM-1、4、5、11a2）VIM-2、3、6、8、9、10、11b3）VIM-7VIM型金属酶分布•VIM-11999年意大利铜绿氧化木糖产碱杆菌恶臭假单胞2003－2004希腊大肠肺克法国肺克•VIM-22000法国铜绿意大利希腊日本韩国葡萄牙西班牙波兰克罗地亚智利阿根廷美国中国•VIM-32001年台湾地区铜绿•VIM-42002年希腊铜绿2003瑞典铜绿2004意大利肺克阴沟2004波兰铜绿•VIM-52004土耳其肺克铜绿•VIM-62004新加坡恶臭假单胞•VIM-72004美国铜绿•VIM-8哥伦比亚铜绿•VIM-9，10英国•VIM-11阿根廷意大利VIM型金属酶分布亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶检测结果北京（27）上海（32）杭州（27）广州（32）成都（22）金属酶表型阳性菌株数35310百分率11.1％15.6％11.1％3.1％0.0％金属酶基因型阳性菌株数36410百分率11.1％18.8％14.8％3.1％0.0％VIM-2基因整合子结构图A：B2，B3，B28，H19，H26，H54，G4结构同In72B：S5，S9，S10，S11，S12（S15、H22除外）intI1attI1aacA459-bVIM-259-beaadB59-be3’-CSintI1attI1aacA459-beVIM-259-be3’-CSABH22H26g4s5s9s10s11s12s15b2b3b28w19w54Marker50kbABH22H26g4s5s9s10s11s12s15b2b3b28w19w54MarkerPFGE谱分析结果：共有七种类型，来自上海的六株为同一类型，来自北京的三株分两个类型，来自杭州的四株同样也分两个类型。各地区之间的类型各不相同。反复尝试通过接合试验及质粒抽提物电转化传递金属酶基因均未获成功。经XbaI内切酶消化的染色体PFGE与VIM-2探针杂交显示其中10株铜绿假单胞菌50-kb大小的酶切片段杂交阳性，而其余3株（H22、H26、B2）没有阳性片段。Ａ类酶包括阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌中由染色体介导的NMC-A、Sme-1～Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导的KPC-1-4酶、铜绿假单胞菌中质粒介导的GES-2酶。碳青霉烯类抗生素水解酶二株产IMI-1阴沟肠杆菌PFGE结果AntibioticsMIC(mg/l)EcloacaeEC600E.coliC600E8E.coliDH5E.colipT103Imipenem≥320.38≥320.25≥32Ciprofloxacin0.0640.250.250.006008Amikacin4220.250.38Cefepime20.0640.0640.1250.047Ceftazidime160.50.380.50.25Cefotaxime120.050.1250.0940.047Cefoperazone≥2560.51.50.0474Cefoperazone/Sulbactam1280.25262Piperacillin/Tazobactam≥2562424Ticarcilliin/ClavulanicAcid≥2561232432Ampicillin/Sulbactam≥2568641.5NDEcloacae8,EC600,E.coliC600E8，E.colipT103和E.coliDH5对抗菌药物的体外抗菌活性阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图谱M1ABM254kb15kbSchematicrepresentationoftheclonedE.coRⅠfragmentIS903IMI-2Imi-2RIS903IS2903bp921bp882bp876bp921bp10629bp(GenBankaccessionnumber:AY780889)Imi-R与ImiR同源性为97%。IMI-2与IMI-1同源性99%，仅在37位由天冬氨酸→天冬酰胺，106位由组氨酸→酪氨酸抗菌药物肺炎克雷伯菌亚胺培南32亚胺培南/克拉维酸16美罗培南32美罗培南/克拉维酸16厄他培南256头孢他啶256头孢他啶/克拉维酸256头孢噻肟256头孢噻肟/克拉维酸256头孢吡肟256头孢曲松256头孢西丁256氨曲南256头孢哌酮/舒巴坦256哌拉西林/三唑巴坦256环丙沙星32阿米卡星256多重耐药肺炎克雷伯菌转化试验•抽提亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌质粒•转化DH5α，在含1g/ml的亚胺培南的MH平板上筛选•成功筛选到亚胺培南耐药的转化菌（转化质粒约60kb）染色体带61kbPCR•PCR筛选β内酰胺酶耐药基因包括TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM、OXA-10和KPC-1•以肺炎克雷伯菌质粒DNA为模板PCR阳性为TEM、SHV和KPC•转化菌和克隆菌只有KPC阳性•PCR