基于罗丹明B的阳离子荧光探针的研究

基于罗丹明B的阳离子荧光探针的研究.1分子荧光产生的原理当用紫外或可见光照射某些物质时，这些物质吸收某种波长的光后会发射出波长和强度各不相同的光线，当停止照射后，这种红光也随之消失，这种光被称为荧光汇1.2〕。对荧光产生原理和条件直到十世纪中期才弄清楚。GorgeGStokes在1852年详细考察了奎宁和叶绿素的荧光后，首先确定和报告了他们的荧光波长总比激发波长要长。他还研究了荧光强度和荧光物质浓度的关系，发现在高浓度时荧光会淬灭，他也发现荧光可以被外部物质淬灭，从而建议利用荧光达到检测的目的。由AlexanderJabfonski在1935年提出的荧光产生的过程图，常被称为Jabfonski图131(见图1.1)。通常情况下，荧光试剂分子处于基态，吸收光后，试剂分子的电子被激发而处于激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两种类型。S为电子自旋量子数的代数和，其数值为O或1。S为O时，Fig.1.1JalllonskidiagramforaPhotolu刀。刃。eseentsystem分子内轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单线态，大多数有机物分子的基态是处于单线态。分子吸收光能后，电子越迁到高能级，电子自旋方向不变，此时分子处于激发单重态。S。，51，52，.…，表示分子的基态和第一，第二，…，激发单重态，能量由低到高。如果处于基态单重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有电子自旋方向的变化，在激发态分子轨道中就有两个自旋不配对的电子，此时S=l，表明分子处于激发态的三重态，用T表示，Tl，T:分别表示三重态的第一第二激发态，分子中的电子从基态S0跃迁到激发态51，52，比较容易发生，进行很快(10飞)，而从基态单重态到激发三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子(如S:)可以与其它同类分子或溶剂分子碰撞通过内转换回到激发态的最低能级51，这一过程为10一，25，处于激发态最低能级的分子寿命一般为10礴一10一ss，它们会放出光子返回基态，这时产生的光就是荧光。从51到Tl能量转化是系间跨越。从Tl到S。有两种过程:一个事物能量释放;另一个是放出光子，即磷光，在104一105间完成。1.2荧光分子探针的定义荧光探针定义为能和个别组织特异结合而又不干扰其他组织成分自身荧光的那些荧光化合物，为了和细胞中的自发荧光物质相区别，人们也曾称荧光染料为次级荧光体，相应地把这种染色过程称为次级染色，把像叶琳这样的自然荧光物质称为初级荧光体。而现在把所有的荧光探针，不管其染色性能和对天然荧光的影响如何，都统称为荧光探针〔‘〕。荧光探针大多是含有共扼双键体系的有机化合物，共辆双键使其容易吸收激发光，其激发波长多处于近紫外区或可见光区，发射波长多处于可见光区。作为荧光探针应该具有以下特点〔4]:第一，荧光探针的荧光必须与生物样品的背景荧光易于区别;第二，荧光探针必须不干扰研究的主体;第三，荧光探针主要用于生物活体或在天然生物条件下的体外样品的研究，所以荧光探针的毒性、使用的pH范围，生物相容性等方面都有严格的要求。目前使用的荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类，香豆素类等化合物，它们被称为“在化学反应中与无荧光的化合物之间形成化学键的物质”〔5〕。.3荧光分子探针的结构1切.时.成晚\‘丫‘‘一\、了尸/\一产叮/梦夕盆;.护，..。吃.纽如，.加妙图1.2荧光探针的结构模型Fig.1.2AstrUetura】modeloffluoreseentProbe荧光分子探针一般由两部分组成(图1.2):(l)识别基团，能选择性地与被分析物结合(一般形成络合物的形式)，这使分子探针所处的化学环境发生改变;(2)荧光基团，将大连理工大学硕士学位论文识别基团与被分析物络合所引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号(如荧光)。.4荧光探针与分子结构的关系荧光探针的荧光特性首先取决于其自身的分子结构，其次是环境因素的影响。大量研究结果表明，荧光探针的性能与探针的共辘体系大小、共辘二键体系的共平面性和刚性程度、分子母体上取代基的种类及取代基位置和几何构型等因素相关〔6〕。共扼体系越大，离域二电子越易激发，越易产生荧光，荧光强度往往越强。但是芳香环或共扼体系增加到一定程度时，只是荧光发射波长向长波方向红移，这与共扼二键体系的共平面性和刚性有关。同一体系的芳香族化合物，线性结构的荧光波长比非线性的长〔，，。强的荧光试剂除了具备大的共扼二键体系还必须具备平面性和一定程度的刚性。含有给电子取代基的荧光化合物，其荧光强度一般都会增强。这类基团如:一NHZ，一NHR，一RZ，一oH，一OR和一CN。含有吸电子取代基的荧光化合物，其荧光强度一般都会减弱。属于这类取代基的有一C二O，一COOH，一CHO，一NO:和一=N一。荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。重原子的取代，一般指的是卤素(Cl，Br和I)的取代。芳烃取代重原子后，荧光强度一般随卤素原子量的增加而减弱，这一效应称为“重原子[8]此外，溶液中的温度、溶剂pH等环境因素对分子荧光也可能会产生一定程度的应响效影5荧光分子探针的识别原理1.5.1光诱导电子转移典型的光诱导电子(Photofnducedelectrontransfer，PET)转移体系是由包含电子给体的受体部分R(rec印tor)，通过间隔基S(sPacer，如一CHZ一)和荧光团F(fluorophore)相连而构成的件川。其中荧光团部分是能吸收光和荧光发射的场所，受体部分则用来结合客体，这两部分被间隔基隔开，又靠间隔基相连成一个分子，构成了一个在选择性识别课题的同时又给出信号变化的超分子体系。PET荧光分子探针中，荧光团与受体单元之间存在着光诱导电子转移，对荧光有非常强的淬灭作用，通常是电子从供体转移到激发态荧光团(还原型PET)。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光，或荧光很弱。一旦受体与客体结合，光诱导电子转移作用受到抑制，甚至被完全阻断，荧光团就会发射荧光(图1.3)。基于罗丹明B的阳离子荧光探针的研究心心娜打打g拍滋/////眠眠印打打图1.3PET荧光分子探针识别客体原理图Fig.1.3The西neiPleofguestreeognitionbyPETfluoreseenimoleeularProbePET荧光分子探针的作用机制可由前线轨道能量来说明(图1.4)，荧光团受到激发后，其最高占有分子轨道(HOMo)上的电子被激发跃迁到最低不占有分子轨道(LUMO)上，这使得供体(属于受体部分)HoMo轨道上的电子能被光诱导转移到荧光团的HoMo轨道上，引起荧光团的荧光淬灭。在受体与客体相结合后，供体的氧化还原电位增加，其HOMO轨道的能级变得比荧光团的HOMO轨道的能级低，结果光诱导电子转移不能LUMOHoM。一卜盛}Lu。州产UI】HOM。!以流帕州杰一。、{’一寸中一HOMO任XC打三DFLUOROpHORE限EER〔C〔内心REXCIT住OFLUOROPHOREBOUNDR〔CE门心R图1.4PET机理的前线轨道理论示意图Fig.1.4FroniierothitalenergydiagramsillustratingthemeehanismofPET再发生，荧光淬灭被抑制。由于与客体结合前后，荧光强度差别呈明显的“关”、“开”状态，这类探针又被称作荧光分子开关。到目前为止，PET机理己被广泛用来设计功能有机分子，有大约6000多篇相关的化学文献被报道。科学家们通过PET机理设计了很多功能有机分子器件，其中包括分子器、电化学传感器[’2]、开关[’3]、光电电池[’4]、非线性光学材料[”]、荧光分子探针[‘“]等。PET是人们在设计荧光分子探针时使用的最为广泛的原理之一，多数荧光分子探针是以脂肪氨基、或氮杂冠醚作为受体单元。化合物1是第一个最简单的PET荧光分子探针[’7]，在甲醇中和K+络合后，其荧光量子产率从0.003增加到0.14。吴云扣等[’8]合成的以二(2-毗陡甲基)胺为识别基团、BoDIPY为荧光团的PET荧光分子探针2，对pH不敏感，其PKa被降为2.1，它的细胞渗透性很好，在细胞内zn2+的荧光显微成像研究获得了满意1文献综述1.1分子荧光产生的原理当用紫外或可见光照射某些物质时，这些物质吸收某种波长的光后会发射出波长和强度各不相同的光线，当停止照射后，这种红光也随之消失，这种光被称为荧光汇1.2〕。对荧光产生原理和条件直到十世纪中期才弄清楚。GorgeGStokes在1852年详细考察了奎宁和叶绿素的荧光后，首先确定和报告了他们的荧光波长总比激发波长要长。他还研究了荧光强度和荧光物质浓度的关系，发现在高浓度时荧光会淬灭，他也发现荧光可以被外部物质淬灭，从而建议利用荧光达到检测的目的。由AlexanderJabfonski在1935年提出的荧光产生的过程图，常被称为Jabfonski图131(见图1.1)。通常情况下，荧光试剂分子处于基态，吸收光后，试剂分子的电子被激发而处于激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两种类型。S为电子自旋量子数的代数和，其数值为O或1。S为O时，口口口口口口......尸尸尸拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥拥陌陌陌陌陌陌陌‘一_毛砂砂口口口口口口口口口...............吮吮.明冲目..口目.栩...!!!潺潺「「少.州腼‘.，气产产胜胜胜胜胜胜胜胜胜胜}}}}}的的厂创‘一‘了韶女女{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{{曰峭柑备卜洲.咐..甲甲甲甲甲’’’’’’’’’’’’’-了口口翻.阅匆们~2。石;;;_________________________勺/\气{}{{{口口口口口[[[l!!!口口口口口口口口口口口}天认卜.户洲目拍扮口自”‘*‘:::口口口口口巨巨巨口口口口口口口口口‘袅Z、4奋奋口口口口口口口!111口口口口口口月月图1.1发光系统的Jablonski图Fig.1.1JalllonskidiagramforaPhotolu刀。刃。eseentsystem分子内轨道中的所有电子自旋配对，自旋方向相反，此时分子处于单线态，大多数有机物分子的基态是处于单线态。分子吸收光能后，电子越迁到高能级，电子自旋方向不变，此时分子处于激发单重态。S。，51，52，.…，表示分子的基态和第一，第二，…，激发单重态，能量由低到高。如果处于基态单重态的有机物分子的电子在跃迁过程中伴随有电子自旋方向的变化，在激发态分子轨道中就有两个自旋不配对的电子，此时S=l，表明分子处于激发态的三重态，用T表示，Tl，T:分别表示三重态的第一第二激发态，分子中的电子从基态S0跃迁到激发态51，52，比较容易发生，进行很快(10飞)，而从基态单重态到激发三重态不易发生。高能量的单重态激发态分子(如S:)可以与其它同类大连理工大学硕士学位论文的结果。G皿川angsson研究小组【’9]设计合成了含氨梭酸基团的化合物3在pH较高的介质中稳定，并且水溶性好。当PH3时，其荧光被淬灭，因此，化合物3可用在竞争性pH介质中，如在生理pH条件下。忿曝图1.5四种PET荧光分子探针Fig.1.5FourPETfiuoreseentProbes多数PET荧光分子探针是基于受体和客体的结合，抑制了从受体到荧光团的光诱导电子转移，从而使荧光团发射出强荧光的原理设计的。但是，当与过渡金属作用时，结果有时会发生变化。由于过渡金属的3d电子的氧化还原行为，可以发生从荧光团到络合的过渡金属的电子转移，或者从过渡金属向荧光团的电子转移，因此，可以通过无辐射能量转移使荧光淬灭。化合物4的分子设计也是基于PET过程[20】，但不同的是，当络合客体后，产生了从荧光团到金属离子的氧化PET过程，导致荧光淬灭。5.2分子内电荷转移当直接连有供电子基(通常是氨基)的荧光团和一个吸电子基共扼连接时，在光的激发下，分子内就会发生从电子供体到电子受体的电荷转移。典型分子内电荷转移(intr田刀olecularchargetransfer，IcT)[2‘一2