第二章 微生物的纯培养和显微技术

第二章微生物的纯培养和显微技术•无菌技术•纯种分离技术•培养技术•显微技术•显微镜下的微生物微生物的基本特点：小在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性；微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；培养技术在微生物学中具有重要意义！在研究中使用单个的微生物来培养群体：培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体混合培养物:含有多种微生物的培养物；纯培养物:只有一种微生物的培养物；通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果纯培养技术是进行微生物学研究的基础！微生物个体微小的特点决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究微生物的基本特点：小第一节微生物的分离和纯培养•无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止其他微生物污染的技术。是微生物学研究的关键技术。1、常用器具及灭菌2、接种操作常用的器具：试管、三角瓶、培养皿等1887年，RJPetri发明Petridish高温干热灭菌高压蒸汽灭菌试管、瓶子、培养皿等常用的灭菌方法：常用的器具：2、接种操作无菌操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行2、接种操作无菌操作：在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行•用固体培养基分离纯培养：使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法。稀释菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。菌苔：固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。菌落或菌苔的特征可作为微生物分类、鉴定的依据。1、稀释倒平板法2、涂布平板法3、平板划线分离法4、稀释摇管法厌氧菌不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。1、稀释倒平板法2、涂布平板法操作较麻烦,对好氧菌、热敏感菌效果不好使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀3、平板划线法4、厌氧微生物的分离稀释摇管法•用液体培养基分离纯培养极限稀释法必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。缺点：只能分离出混杂微生物群体中数量占优势的种类。•单细胞（单孢子）分离一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；操作技术要求高，且细胞越小，难度越高。•选择培养分离通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术。1、利用选择培养基进行直接分离2、富集培养•选择培养分离抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快。使待分离的微生物在群落中的数量上升,方便用稀释法对其进行纯化。微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。使待分离的微生物生长“突出”直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。1.利用选择平板进行直接分离待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制高温下培养:分离嗜热细菌培养基中不含N:分离固氮菌培养基加抗生素:分离抗性菌1.利用选择平板进行直接分离待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物颜色反应:分离特定的菌株牛奶平板:分离蛋白酶产生菌利用特定细菌的滑动特点进行分离纯化；选择培养分离2.富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加2.富集培养富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一.营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。根据微生物的特殊要求,从自然界分离出特定已知微生物种类；分离培养在特定环境中能生长的微生物。•二元培养物培养物中只含有二种微生物，而且有意保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。•微生物的保藏技术菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。连续移种令菌株的代谢水平降低乃至停止，使其休眠1、传代培养保藏缺点：繁琐、易污染、易退化2、冷冻保藏3、干燥保藏由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。第二节显微镜和显微技术分辨率，反差•显微镜的种类及原理普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描隧道显微镜•显微观察样品的制备•1、光学显微镜的制样•活体观察压滴法悬滴法菌丝埋片法•染色观察正染色负染色2、电子显微镜的制样细菌染色法死菌正染色负染色：简单染色法鉴别染色法革兰氏染色法抗酸性染色法芽孢染色法荚膜染色法等活菌:用美蓝或TTC（氯化三苯基四唑）等作活菌染色姬姆萨染色法染色观察第三节显微镜下的微生物•细菌和古细菌细菌细菌细胞形态球菌(Coccus)杆菌(Bacillus)螺旋菌(Spirlla)其他形状的细菌球菌(coccus)单球菌双球菌四联球菌八叠球菌葡萄球菌链球菌.................................................（显微镜下示意图）单球菌(singlecoccus)双球菌(doublecoccus)......................................................................上：显微镜效果下：电镜照片四联球菌(Micrococcuslactis)八叠球菌八叠球菌(Sarcinaureae)八叠球菌（显微镜下示意图）左：电镜照片右：显微镜下的金黄色葡萄球菌葡萄球菌(Staphylococcusaureus)链球菌链球菌（显微镜下示意图）链球菌（电镜照片）显微镜下的杆菌杆菌(bacillus)电子显微镜下的结核菌（绿色的就是结核杆菌）杆菌动物宿主细胞感染杆菌濒临死亡电镜照片链杆菌螺旋菌（Spirlla)弧菌(vibrio)螺菌（spirllum）螺旋体(spirochaeta)显微镜下的螺旋菌幽门螺旋菌左：显微数码摄像右：结构示意图细菌电子显微镜照片细菌细胞的大小普通光学显微镜下用测微尺测细菌大小细菌细胞的大小细胞的大小是细菌分类特征不同细菌细胞大小不同同一细菌的不同菌龄细胞大小不同细菌细胞大小还与营养等因素相关细胞大小的测量结果只是近似值或平均值细菌群体的形态（细菌的培养特征）细菌的菌落特征细菌的其它培养特征细菌的菌落特征固体培养基表面细菌菌落（照片）Colonymorphology细菌菌落特征剖面图细菌菌落特征正面图细菌在琼脂培养基中穿刺培养的生长特征细菌在半固体培养上的培养特征细菌在明胶培养基中穿刺培养并液化明胶的特征在液体培养基内的群体形态•混浊•沉淀•菌醭•菌膜细菌的繁殖细菌的繁殖方式主要为裂殖，少数种类进行芽殖。裂殖：一般进行横分裂。•二分裂•三分裂•复分裂芽殖：DNA结合位点细菌繁殖方式古细菌古细菌多生活在极端的生境或生命出现初期的自然环境中，营自养和异养生活；具特殊的生理功能，如在超高温、高酸碱度、高盐及无氧状态下生活。古生菌可分为5个类群：产甲烷古生菌还原硫酸盐古生菌极端嗜盐古生菌超嗜热古生菌热原体如：产甲烷的古生菌放线菌(actinomyces)什么是放线菌放线菌的形态构造放线菌的繁殖放线菌的菌落特征放线菌的生理放线菌与人类生活放线菌是一类具有丝状分枝细胞的细菌有原核菌丝直径与细菌相仿细胞壁的主要成分是肽聚糖最适生长pH一般呈微碱性DNA重组的方式与细菌的相同核糖体同为70S对溶菌酶敏感凡细菌所敏感的抗生素，放线菌也同样敏感有的放线菌产生有鞭毛的孢子,其鞭毛类型与细菌相同放线菌的分布与生活方式放线菌一般分布在含水量较低；有机物丰富和呈微碱性的土壤中。107个／g左右能看到：北方春季深层黑土地的白丝能闻到：泥土特有的“泥腥味”放线菌的形态结构（模式图）气生菌丝孢子丝分生孢子基内菌丝固体基质基内菌丝（Substratemycelium)又称营养菌丝，功能是吸收营养，直径0.2-1.2um长度100－600um，色素可有可无。基内菌丝气生菌丝（Aerialmycelium)基内菌丝长到一定时期，长出培养基外，伸向空间的菌丝，直径1－1.4um,长短不一，形状不一，颜色较深。气生菌丝孢子丝(Reproductivemycelium)当气生菌丝生长发育到一定阶段，气生菌丝上分化出的可形成孢子的菌丝。孢子的形状及在气生菌丝上排列的方式随种而异。放线菌孢子丝类型直形弯曲丛生成束单轮生无螺旋开环钩形原始螺旋形松螺旋紧螺旋螺旋单轮生无螺旋两级轮生螺旋两级轮生放线菌的菌落形态菌落质地硬而且致密，菌落小而不广泛延伸菌落表面呈紧密的绒状或坚实、干燥多皱。接种针难以挑取，有时可挑碎，有时可将整个菌落挑起。幼龄菌菌落与细菌难以区分。老龄菌菌落周围具放射状菌丝由于菌丝和孢子常具不同色素，使菌落正面，背面呈不同色泽。2.2.3放线菌的生活史：孢子萌发基内菌丝气生菌丝孢子丝5孢子丝分化形成的孢子放线菌生活史放线菌的繁殖放线菌的繁殖方式分生孢子孢子囊孢子菌丝断裂其他方式（2）沿横隔断裂形成孢子（3）成熟孢子（1）孢子丝中形成横隔横隔断裂形成孢子的过程分生孢子繁殖孢子囊孢子繁殖粉红链孢霉孢子囊形成过程孢子囊形成初期孢子囊继续生长成熟孢子囊放线菌生理绝大多数为异养型，能利用不同的碳水化合物。氮源以Pr,蛋白胨，以及某些氨基酸最合适，硝酸盐、铵盐和尿素次之.一般都需要金属离子。大多放线菌是好气性的。最适温度23－370C放线菌与人类绝大多数抗生素由放线菌产生用来生产抗生素、酶、维生素具固氮作用，用于生产生物菌肥少数寄生型放线菌可引起动植物病害有的放线菌能破坏棉毛织品和纸张链杆状丝状聚合体球状（正在分裂）蓝细菌的形态蓝细菌生理是光能自养型生物：只需空气、阳光、水分、少量无机盐没有有性生殖，以裂殖为之，也可芽生殖，极少数有孢子已知蓝细菌有20多种具固氮作用。支原体、立克次氏体和衣原体同属G-，是代谢能力差，主要营细胞内寄生的小型原核生物。从支原体、立克次氏体至衣原体，其寄生性逐步增强。是介于细菌与病毒之间的一类原核生物。其他几种原核微生物•真菌霉菌：一类丝状真菌的统称。酵母菌•藻类：大多有叶绿素，可进行光合作用，放出氧气的真核微生物。•原生动物：缺少真正细胞壁，细胞通常无色，具有运动能力，呑噬营养的单细胞真核生物。本章小结1、无菌操作技术和显微技术是微生物学研究的重要技术。2、纯培养是微生物分离、纯化与复壮的基础工作，是研究与利用微生物资源的关键环节。3、传代培养、干燥保藏、冷冻保藏是常用的微生物保藏技术。4、不同的微生物在显微镜下，其大小和形态不同。对微生物的观察效果决定于显微镜的分辨率和反差。作业：名词解释：无菌技术、菌落、菌苔实验设计：设计实验分离一种产蛋白酶的微生物。简述微生物的保藏技术的基本原理及常用方法。P36.思考题1.