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广东医学院2004级研究生开题报告Survivin与鼻咽癌放射残存细胞Tr-12放射抵抗的关系探讨研究生：毕宏导师：孙宁教授时间：2005年8月20日立题依据立题依据•放射治疗是鼻咽癌的首选治疗手段，但放射后5年生存率较低，局部复发和远处转移是放疗失败的原因。•放射后存活细胞对放射的抵抗是放疗后复发和转移的基础。•明确放射抵抗的机理可提高放疗的局部控制率和完全缓解率。立题依据研究证明肿瘤细胞对放射的反应主要受基因控制在受放射细胞中DNA链断裂，伴有细胞周期、生长因子、信号转导、基因表达的改变照射存活后代放射抵抗机制可能与：凋亡减少;增殖减慢;DNA损伤修复能力增强有关survivin基因•Survivin是IAPs家族中分子量最小但抗凋亡能力最强而倍受关注的明星分子•位于染色体17q25，全长15kb，含4个外显子，3个内含子，编码分子量为16.5kD的蛋白质•羧基末端缺乏环指结构，氨基端只含有一个包含保守的Cys/His的BIR功能区Survivin的组织分布•胚胎和胎儿组织中大量表达，分化成熟的正常组织无表达•特异性地表达于多数肿瘤组织survivin基因的主要功能•抑制凋亡Caspase途径：caspase-3/7非caspase途径：NFκBsurvivin基因的主要功能•参与细胞周期调控特异性地表达于G2/M期survivin基因的主要功能•参与血管的生成•参与DNA损伤后修复survivin参与肿瘤放疗抵抗的机制参与放射引起肿瘤细胞DNA损伤修复的调节survivin参与肿瘤放疗抵抗的机制阻滞细胞周期于放射不敏感期survivin参与肿瘤放疗抵抗的机制阻止自发性和放射诱导性凋亡以Survivin为靶点的肿瘤放射增敏•Survivin核酶Pennati等用靶向Survivin的锤头状核酶作用于两个过表达Survivin的黑色素瘤细胞株，γ-射线照射后，与亲代细胞相比，表达核酶的细胞克隆形成率下降，caspase-3活性提高，凋亡水平增加以Survivin为靶点的肿瘤放射增敏•Survivin反义寡核苷酸Cao等在肺癌小鼠模型中，瞬时转染survivin与XIAP的反义寡核苷酸能显著下调它们的表达，反义治疗联合放疗组的移植瘤出现了超过15天的生长延迟以Survivin为靶点的肿瘤放射增敏•siRNA干扰Kappler等以survivinsiRNA转染肉瘤细胞，发现survivin表达明显下降，且肿瘤细胞的放射敏感性随照射剂量的增加而增加。姜黄素放射增敏的研究进展姜科姜黄属植物姜黄CurcumalongaL．(C．domesticaValet．)是一种常用中药，药用其根茎抗炎抗氧化抗凝降血脂抗动脉粥样硬化及抗肿瘤姜黄素放射增敏的研究进展我室黄小军、曹璋的实验已证明姜黄素通过改变细胞周期对鼻咽癌放射抵抗细胞的增敏作用创新之处探讨survivin与鼻咽癌细胞放射抵抗的关系以及姜黄素对survivin表达的影响，为鼻咽癌的放射增敏提供理论依据研究目标研究目标探讨survivin的表达与鼻咽癌细胞放射抵抗的关系，姜黄素作用对survivin表达及放射敏感性的影响，为鼻咽癌预后的判断，放疗后复发的治疗及放射增敏提供理论指导研究目标对比慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鳞状细胞癌及放疗后复发鼻咽癌survivin及caspase-3蛋白表达，研究内容研究内容•CNE-2Z及其放射残存细胞tr12的培养。•分别检测两个细胞株的自发凋亡水平，然后施以不同剂量(暂定为2、4、8、10Gy)的照射，培养一定时间后用hoechst33342/PI双染法检测凋亡水平；RT-PCR检测survivin的mRNA水平；比色法测caspase-3的活性变化研究内容•收集慢性鼻咽炎、鼻咽低分化鳞状细胞癌、放射后复发的鼻咽癌标本各20例，用MSP法测fhit基因甲基化是否存在及甲基化率，用免疫组织化学法测PKC的表达。研究内容•对Tr-12细胞做姜黄素的细胞毒实验（MTT法），取低毒性剂量联合照射（不同剂量）作用于Tr-12细胞，设对照组、单纯加药组、药物联合放射组、单纯放射组。各组细胞用克隆形成实验绘制放射-存活曲线；RT-PCR检测survivin的mRNA水平，免疫细胞化学检测survivin和caspase-3的表达研究内容•收集慢性鼻咽炎、鼻咽分化性非角化型鳞状细胞癌、放射后复发的鼻咽癌标本各30例，免疫组化检测survivin与caspase-3蛋白的表达技术路线一、实验病理部分CNE-2Z细胞培养Tr-12细胞培养姜黄素细胞毒实验(MTT)不同剂量照射空白对照组空白对照组不同剂量照射姜黄素加照射姜黄素阈下剂量克隆形成实验RT-PCR测survivin,caspase-3mRNA水平比色法测caspase-3活性hoechst/PI双染测凋亡水平免疫细胞化学测survivincaspase-3蛋白表达二、临床病理部分慢性鼻咽炎鼻咽分化性非角化型鳞状细胞癌放疗后复发鼻咽癌Survivin蛋白表达免疫组化Caspase-3蛋白表达免疫组化拟解决的关键问题•CNE-2Z及其放射残存细胞tr-12的培养。•放射后复发的鼻咽癌标本的收集。预期结果预期结果•照射前和不同剂量照射后Tr-12细胞株中survivin的表达明显高于CNE-2Z；caspase-3的活性在CNE-2Z中比Tr-12中高；hoechst/PI双染法测凋亡水平在CNE-2Z中高于Tr-12预期结果•姜黄素一定浓度作用于Tr-12后，survivin的表达低于作用前，照射与姜黄素联合组比单纯照射组的存活分数低，免疫细化显示survivin的表达也比单纯照射组低。•慢性鼻咽炎中survivin表达几乎为零，鼻咽低分化鳞癌中survivin表达水平低于放疗后复发的鼻咽癌，caspase-3的表达与survivin呈反相关。经费预算•细胞培养基本材料及放射费2000元•caspase-3活性检测2000元•免疫组化试剂2000元•hoechst/PI双染3000元•姜黄素1000元进度安排•2006年3月至2006年5月培养细胞，免疫组化预实验及石蜡标本中survivin、caspase-3表达的检测。•2006年6月至2006年10月，对细胞照射，检测survivin的mRNA水平，caspase-3活性，细胞凋亡水平。•2006年11月至2006年12月测姜黄素的放射增敏作用。•2007年1月至2007年3月整理数据，撰写论文