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实验三十氧化亚铁硫杆菌的生理研究一、目的要求1．了解氧化亚铁硫杆菌(T.f)的特性；2．掌握T.f菌生长曲线测定的方法；3．T.f菌氧化生理研究。二、实验原理氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillusferrooxidans，简称T.f菌)是一种革兰氏阴性菌，具有化能自养、好气、嗜酸、适于中温环境等特性，广泛存在于酸性矿山水及含铁或硫的酸性环境中。像光合作用一样，T.f菌能固定CO2作为合成细胞的碳源;与光合作用不同之处是T.f菌利用环境中无机物的氧化获取生长繁殖所需的能量。通过氧化磷酸化作用，T.f菌从2价铁(液相游离态或结晶状态)获得电子，将2价铁氧化为3价铁离子，所得电子经一系列传递过程合成能量货币ATP，最后将电子传递给O2。宏观反应可表示为2H++2Fe2++1/2022Fe3++H20T.f菌能够浸出矿物中的有价金属，人们利用这一现象已开始应用于矿业冶金，并提出了细菌浸出的直接间接作用机理。直接作用指附着细菌直接催化矿物氧化分解，从中直接得到能源和其它矿质营养元素。间接作用指依靠细菌的代谢产物——硫酸亚铁的氧化作用，细菌间接地从矿物中获得生长所需的能源和基质。具体来说，直接作用和间接作用发生如下化学反应：直接作用：MS+2O2——→M2++SO42-间接作用：4Fe2++4H++O2——→4Fe3++2H2OMS+2Fe3+——→M2++2Fe2++S02S0+3O2+2H2O——→2H2SO4在此过程中T.f菌充当催化剂的角色。酸性环境中无催化剂条件下，空气氧化Fe2+进行的很慢。T.f菌的参与可使反应速度提高105-106倍。亚铁滴定测定法：亚铁测定用重铬酸钾标准滴定法，样品用量2ml，移入20ml的硫磷酰强酸性溶液中，然后用1.755g/L的重铬酸钾溶液进行滴定，也可视样品中亚铁浓度将滴定药剂进行稀释后再行滴定，前者滴定1ml即相当于含有亚铁0.002g，后者则再除以稀释倍数；指示剂为0.2%的二苯胺硫酸钠，当变为紫色时即为终点；硫磷酰配比为浓硫酸150ml：150ml浓磷酸：700ml蒸馏水。pH的测定：用pH计。三、菌种及仪器菌种：氧化亚铁硫杆菌（Thiobacillusferrooxidans）主要仪器：烧杯（1000ml、500ml）、三角瓶（若干）、药匙、电子天平、玻璃棒、电炉、PH试纸、2ml移液管、摇床、洗瓶、酸性滴定管、小烧杯（10ml）血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。实验药品及试剂：(NH4)2SO4、KCl、K2HPO4、MgSO4·7H2Ｏ、Ca(NO3)2、1:1H2SO4溶液、蒸馏水、FeSO4·7H2Ｏ、硫磷酰强酸性溶液（强硫酸150ml+强磷酸150ml+蒸馏水700ml）、1.755g/L的重铬酸钾溶液、0.2%的二苯胺硫酸钠。四、实验步骤：1.培养基的配置：(NH4)2SO43.0(g/L)、KCl1.0(g/L)、K2HPO40.5(g/L)、MgSO4·7H2Ｏ0.5(g/L)、Ca(NO3)20.01(g/L)，按此配方加蒸馏水配溶液1000ml,用1:1H2SO4调pH约2.5。2.接种向250ml三角瓶内加入100ml培养基，121℃灭菌20min，冷却后加入FeSO4·7H2O44.7(g/L)，接种。接种量为5%（V/V），于30℃、150rpm恒温振荡器培养。3.亚铁氧化率测定每隔6小时取培养液2ml，加入20ml硫磷酸和5-8滴二苯胺硫酸钠指示剂，然后用重铬酸钾溶液滴定。当指示剂变为紫色即为终点。记录下滴定ml数，每ml相当于0.002g亚铁。4.生长曲线测定每隔6小时取培养液5ml加入试管，加草酸铵结晶紫1ml，混匀用血球计数器显微镜下计数蓝色活菌数，重复5次，具体步骤如下：a.菌悬液制备:以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。b.镜检计数室:在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。c.加样品:将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生．d.显微镜计数:加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易看清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5～10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。e.清洗血细胞计数板:使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、思考题1．绘制T.f菌氧化亚铁的曲线；2．绘制T.f菌的生长曲线。