生物化学第四章酶

第三章酶学周口师范学院生命科学系一、酶的概述二、酶的分类与命名三、酶催化作用特性的分子机理四、酶促反应的动力学五、重要的酶类及酶活性的调控六、酶的分离纯化及活力测定主要内容一.酶的概述酶概念•酶是生物体活细胞产生的具有特殊催化活性和特定空间构象的生物大分子，包括蛋白质及核酸，又称为生物催化剂(Biocatalysts)。•绝大多数的酶都是蛋白质(Enzyme和Ribozyme)•酶催化的生物化学反应，称为酶促反应(Enzymaticreaction)。•在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物(substrate)。酶的研究历史•1897年，酶的发现和提出：Buchner（1911诺贝尔化学奖）兄弟用不含细胞的酵母汁成功实现了发酵。提出了发酵与活细胞无关，而与细胞液中的酶有关。•1913年，Michaelis和Menten提出了酶促动力学原理—米氏学说。•1926年，Sumner从刀豆种子中分离、纯化得到了脲酶结晶，首次证明酶是具有催化活性的蛋白质。•1982年，Cech对四膜虫的研究中发现RNA具有催化作用。酶及生物催化剂概念的发展……克隆酶、遗传修饰酶蛋白质工程新酶生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：Enzyme(天然酶、生物工程酶)核酸类：Ribozyme;Deoxyribozyme模拟生物催化剂酶的化学本质大多数酶是蛋白质（Mostenzymesareproteins）1926年美国Sumner脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了酶是蛋白质。20世纪80年代发现某些RNA有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。某些核酸也有酶活性酶是有催化能力的蛋白质酶和一般催化剂的共性1.用量少而催化效率高；2.它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。酶本身在反应前后也不发生变化。3.酶能够稳定底物形成的过渡状态，降低反应的活化能，从而加速反应的进行。酶的催化特性酶的催化作用可使反应速度提高10７–101３倍。如：过氧化氢分解2H2O22H2O+O2.用Fe3+催化，效率为6X10-4mol/mol.S，而用过氧化氢酶催化，效率为6X106mol/mol.S。-淀粉酶催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。1．高效性是指酶在催化生化反应时对底物的选择性，即一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。亦即酶只能催化某一类或某一种化学反应。如：蛋白酶催化蛋白质的水解；淀粉酶催化淀粉的水解；核酸酶催化核酸的水解。2.酶的专一性酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。3.酶反应条件的温和性如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。4.酶活力的可调控性5.某些酶活力与辅酶、辅基及金属离子有关根据酶的组成成分单纯酶(simpleenzyme)是基本组成单位仅为氨基酸的一类酶。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。脲酶、消化道蛋白酶、淀粉酶、酯酶、核糖核酸酶等均属此列。复合酶(conjugatedenzyme)的催化活性，除蛋白质部分(酶蛋白apoenzyme)外，还需要非蛋白质的物质，即所谓酶的辅助因子(cofactors)，两者结合成的复合物称作全酶(holoenzyme)，即：二.酶的分类与命名12根据酶的结构特点及组织形式1.单体酶：只含一条肽链，分子量小，大多数水解酶属于此类。2.寡聚酶：由相同或不同的若干亚基构成。每条肽链是一个亚基，单独的亚基无酶的活力。如乳酸脱氢酶含四个亚基。3.多酶复合体：若干个功能相关的酶彼此嵌合形成的复合体。每个单独的酶都具有活性，当它们形成复合体时，可催化某一特定的链式反应，如脂肪酸合成酶复合体，含有六个酶及一个非酶蛋白质。根据酶的存在位置1.胞内酶：在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶，大多数的酶属于此类。2.胞外酶：在合成后分泌到细胞外发生作用的酶，主要为水解酶。1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：酶国际系统分类法1.氧化-还原酶类Oxido-reductases2.转移(移换)酶类Transferases3.水解酶类hydrolases4.裂合（裂解）酶类Lyase5.异构酶类Isomerases6.合成酶类LigasesorSynthetases氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1.氧化-还原酶类Oxido-reductases转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2.转移(移换)酶类Transferases水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：3.水解酶类hydrolases主要包括醛缩酶、水化酶（脱水酶）及脱氨酶等。裂合酶:催化从底物分子中移去一个基团或原子而形成双键的反应及其逆反应。A+B==A-B例如，苹果酸裂合酶即延胡索酸水合酶催化的反应。4.裂合（裂解）酶类LyaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。5.异构酶类Isomerases合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H==A-B+ADP+Pi例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2草酰乙酸6.合成酶类LigasesorSynthetases1.习惯命名法:根据其催化底物来命名（蛋白酶；淀粉酶）根据所催化反应的性质来命名（水解酶；转氨酶；裂解酶等）结合上述两个原则来命名（琥珀酸脱氢酶）有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点（胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性磷酸脂酶和酸性磷酸脂酶）。酶的命名2.国际系统命名法（国际酶学委员会１９６１年提出）系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。例如：习惯名称：谷丙转氨酶系统名称：丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应：-酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸乳酸脱氢酶EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号酶催化的中间产物理论酶的活性中心酶作用专一性及其机理酶高效催化的分子基础三、酶催化作用特性的机理酶的催化作用与分子活化能在一个化学反应体系中，只有那些具有较高能量，处于活化状态的分子才能在分子碰撞中发生化学反应。活化分子比一般常态分子高出的能量称之为活化能。活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol反应物全部进入活化状态所需的自由能。化学反应要能够发生，关键的是反应体系中的分子必须分子处于活化状态，活化分子比一般分子多含的能量就称为活化能。反应体系中活化分子越多，反应就越快。增加反应体系的活化分子数有两条途径:一是向反应体系中加入能量，另一途径是降低反应活化能。酶的作用就在于降低化学反应活化能。例2H2O2→2H2O+O2反应活化能非催化反应75.24kJ/mol钯催化反应48.9kJ/molH2O2酶催化8.36kJ/mol酶催化的中间产物理论E+SP+EES能量水平反应过程GE1E2酶（E）与底物（S）结合生成不稳定的中间物（ES），再分解成产物（P）并释放出酶，使反应沿一个低活化能的途径进行，降低反应所需活化能，所以能加快反应速度。S+E→ES→P+E底物酶中间产物产物酶酶的活性中心1、酶的活性中心和必需基团酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的区域叫酶的活性中心（activecenter）或活性部位（activesite），参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象所必需的基团为酶分子的必需基团。必需基团:酶分子中有些基团若经化学修饰（氧化、还原、酰化、烷化）使其改变，则酶的活性丧失，这些基团称为必需基团。非必需基团：有的酶温和水解掉几个AA残基，仍能表现活性，这些基团即非必需基团。2、酶的活性的研究手段活酶的专一性研究酶分子的化学修饰：差示标记法，亲和标记法X-射线衍射法必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质AspHisSer胰凝乳蛋白酶的活性中心活性中心重要基团:His57,Asp102,Ser195酶作用的专一性与分子机理酶作用的专一性结构专一性立体异构专一性绝对专一性相对专一性旋光异构专一性几何异构专一性键专一性基团专一性1专一性分类2消化道内几种蛋白酶的专一性（芳香）（赖、精）丙,甘,亮,异亮,缬胰凝乳蛋白酶胃蛋白酶弹性蛋白酶羧肽酶胰蛋白酶氨肽酶羧肽酶“锁钥学说”(lockandkeythoery)：Fischer，(1890）：酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结合成中间络合物。3酶作用专一性机理诱导嵌合学说(induced-fithypothesis)：Koshland，(1958）：酶活性中心的结构有一定的柔性，当底物（激活剂或抑制剂）与酶分子结合时，酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，转入有效的作用位置，这样才能使酶与底物完全吻合，结合成中间产物。1底物与酶的邻近效应和定向效应2底物分子的形变和扭曲3酸碱催化4共价催化5金属离子的作用6活性部位的微环境的影响酶高效催化的分子基础酶分子为酶的催化提供各种功能基团和形成特定的活性中心，酶与底物结合成中间产物，使分子间的催化反应转变为类似分子内的催化反应。•影响酶促反应速度的因素1底物浓度2酶浓度3pH4温度5激活剂6抑制剂•酶的活力与测定四、酶促反应动力学(kineticsofenzyme-catalyzedreactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。酶促反应速度的测定与酶的活力单位酶促反应速度的测定初速度的概念酶活力检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，即用酶的活力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。1酶促反应初速度的概念斜率=[P]/t=V（初速度）[P]t用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示酶促反应速度。测定反应的初速度。2酶活力的表示方法活力单位（activeunit）习惯单位（U）:底物(或产物)变化量/单位时间国际单位（IU）:1μmoL变化量/分钟Katal（Kat）：1moL变化量/秒比活力=总活力单位总蛋白mg数=U(或IU)mg蛋白量度酶催化能力大小转换系数（Kcat）底物（μmoL）/秒·每个酶分子量度酶纯度比活力（specificactivity）量度转换效率3酶活力测定方法终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。1.称取25mg蛋白酶配成25ml溶液，取2ml溶液测得含蛋白氮0.2mg，另取0.1ml溶液测酶活力，结果每小时可以水解酪蛋白产生1500ug酪氨酸，假定1个酶活力单位定义为每分钟产生1ug酪氨酸的酶量。请计算：(1)酶溶液的蛋白浓度及比活力(2)每克酶制剂的总蛋白含量及总活力。解：(1)酶液蛋白浓度：0.2×6.25/2=0.625mg/ml,0.1ml酶液中含1500/60=25u.比活力：25u/0.1×0.625=400u/mg(2)每克酶制剂中总蛋白：0.625克蛋白