第三章 毒素快速检测方法

第三章毒素快速检测方法第一节自然产生的毒素第二节真菌毒素的检测方法第一节自然产生的毒素贝类毒素简介贝类生物体通过食物链，将有毒藻类产生的毒素在体内累积放大，转化为有机毒素，这类毒素统称为贝类毒素。常见的有毒贝类主要由哈类、螺类、鲍类，毒素一般积存于贝类的肝脏、消化腺体、中肠腺等内脏器官。贝类毒素的分类麻痹性贝类毒素（PSP）腹泻性贝类毒素（DSP）神经性贝类毒素（NSP）健忘性贝类毒素（ASP）贝毒危害具有突发性和广泛性，且毒性大，反应快、无适应解毒剂麻痹性毒素（PSP）病原藻：主要来自海洋中的单细胞甲藻，其所产生的毒素为巨蚌毒素。石房哈毒素（STX）新石房哈毒素（neo-STX)膝沟藻毒素（GTX）麻痹性毒素中毒症状主要为神经性症状，包括唇舌麻木感、皮肤刺痛、晕眩、言语困难、四肢末端灼热感等。严重者可能会因呼吸困难、呼吸衰竭而致死。常见于淡菜、哈利、扇贝等双壳贝类。误食会产生以腹泻为主要特征的中毒效应。腹泻性贝毒常见于淡菜、牡蛎、日月贝等贝类。腹泻性贝类毒素贝类毒素简介贝类毒素简介危害范围较小。活性成分为短裸甲藻毒素A，B，半短裸甲藻毒素。神经性贝类毒素神经性贝类毒素中毒症状：主要为消化系统不适症状，包括反胃、呕吐、下痢及腹痛，并伴随着畏寒、头痛、发热等，症状至多持续2-3天。一般并不会造成死亡，其愈后良好。贝类毒素简介病原藻：为菱形藻科中的拟菱形藻属和菱形藻中硅藻的某些种，毒素以软骨藻酸（DA）为主。贝类毒素简介健忘性贝类毒素中毒症状：恶心、呕吐、腹痛、腹泻等；神经系统症状则约48小时内出现，主要症状为记忆丧失、心律不齐、半身麻痹等；严重者则会产生痉挛及昏迷；老年且出现严重神经症状患者易导致死亡，死亡率约2%。健忘性贝类毒素一.河豚毒素的分布1.河豚鱼全球200多种，我国70多种，广泛分布于热带、亚热带海区2.外形：河豚毒素苏轼：“拼死吃河豚”身体浑圆，头胸部大，腹尾部小，背上有鲜艳的斑纹或色彩，体表无鳞，口腔内有明显的2对门牙。鱼类毒素简介河豚鱼身体浑圆，头胸部大，腹尾部小（2）河豚毒素含量依季节而变：春夏季：毒性最强冬季：卵巢、鱼卵中毒素浓度最高（此时味最美）河豚毒素的分布（1）毒素浓度由高到低依次为：卵巢、鱼卵、肝脏、肾脏、眼睛、皮肤、血液，肌肉中含量低。河豚毒素的毒性（1）机制：抑制神经细胞膜的Na+离子通道，阻断神经冲动的传导，使肌肉麻痹。（2）潜伏期：10min~3h，一般为30~60min。唇、舌、手指逐渐变得麻痹，进而加重，恶心、呕吐；随后说话困难，运动失调，血压、体温下降；最后呼吸衰竭而死。二.河豚毒素的毒性（3）LD50（小鼠，经口）为8.7μg/kg毒性比氰化钠强1000倍从一只中等体型河豚中提取的白色粉沫——一片阿斯匹林的1/10大小就可以毒死30个人。青皮红肉鱼海产鱼类中的青皮红肉鱼（如青专鱼、金枪鱼、沙丁鱼、秋刀鱼等）腐败后形成组胺，引起组胺食物中毒。预防的方法是贮存加工中保证鱼的新鲜，防止组胺产生。鱼类毒素简介胆毒鱼类中毒原因：胆汁中含有组胺、胆盐及氧化物。鱼胆中毒主要是胆汁毒素严重损伤肝、肾，造成肝脏变性坏死和肾小管损害。脑细胞、心血管与神经系统亦有改变。鱼类毒素简介肝毒鱼类原因：维生素A中毒。症状：初期为胃肠道症状，以后有皮肤症状，如鳞状脱皮，自口唇周围及鼻部开始，逐渐蔓及四肢和躯干，重者毛发脱落。此外，还有结膜充血、剧烈头痛等症状。鱼类毒素简介第二节真菌毒素及其检测方法真菌毒素概述由真菌产生的具有毒性的次生代谢产物，广泛污染农作物、食品及饲料等植物性产品。已发现300种真菌毒素，具有代表性的有黄曲霉毒素，赫曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮、麦角生物碱等。真菌毒素中毒症及其特点定义人、畜禽食用被真菌毒素污染的食品或饲料后发生的中毒现象，称真菌毒素中毒症，包括肝脏毒性、肾脏毒性、神经毒性等。特点中毒与某些食物有联系有季节性和地区性对真菌毒素不能产生抗体，也不能免疫粮食中主要真菌毒素黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFT)脱氧雪腐镰刀菌烯（Deoxynivlenol,DON)玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN(F-2))黄曲霉毒素（AFT）来源由黄曲霉、寄生曲霉等产生的代谢产物，实际上指是一组化学成分相似的毒素。分布存在于土壤、动植物、各种坚果、谷物、调味品、奶制品、食用油等。黄曲霉素特点黄曲霉毒素的理化性质一般特性：几乎无色，相对分子质量312-346，熔点为268-269℃。易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂。pH9-10的强碱溶液中分解迅速。紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性。产毒微生物黄曲霉：60-94%菌株产毒寄生曲霉：产毒菌株可达100%产毒条件菌体形成孢子温度范围12-42℃，最适产毒温度33℃粮食水分为18.5%。黄曲霉毒素黄曲霉素产毒条件黄曲霉毒素危害强烈的致癌物质，能使得人体或动物的免疫功能丧失，诱导畸形、癌症的发生。急性中毒症状主要表现在呕吐、厌食、发热、黄疸和腹水等肝炎症状。“三致”(致突变、致癌、致畸形）危害性。对人及动物的肝脏组织有很强的毒害作用，严重时可导致肝癌，甚至死亡。食品和饲料中黄曲霉毒素的允许残留标准允许残留量（ug/kg)玉米、花生仁、花生油≤20玉米及花生仁制品（按原料折算）≤20大米、其他食用油≤10其它粮食、豆类、发酵食品≤5婴儿代乳品不得检出由多种生长在霉变粮食（玉米、小麦、大米、燕麦等）、花生、蔬菜、水果和饲料中的青霉属和曲霉属的一些种产生的毒素。赭曲霉毒素真菌毒素赭曲霉毒素该类毒素包括7种结构类似的化合物，包括赭曲霉素A、B、C、D等，其中以赭曲霉素A毒性最大。溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液里，结构稳定，具有较高的耐热性。真菌毒素赭曲霉毒素危害主要对肾产生危害，造成肾肿大，当浓度超过5mg／kg时，就会对肝脏组织和肠产生破坏，引起肠炎、肝肿大，此外具有免疫抑制、神经毒性以及致畸性。限量标准我国《粮食卫生标准》(GB2715—2005)规定赭曲霉毒素A在谷类、豆类中的限量为5ug／kg。伏马毒素串珠镰孢、轮状链孢等链孢菌产生，1988年首次分离出来。目前发现37种衍生物，包括FA1、FA2、FB2、FB3、FB4、FC1等，其中FB1是主要组分。FB1为水溶性霉菌毒素，对热稳定，不易被蒸煮破坏。真菌毒素伏马毒素伏马毒素的存在极其广泛。主要污染玉米及其制品，偶尔在高粱、大米和豌豆中发现。伏马毒素与疯牛病病毒、二恶英、O-157大肠杆菌和氯丙酮五种污染物被当今世界认为是危及人类食品安全的五大热点。伏马毒素危害主要损害肝肾功能，能引起马脑白质软化症和猪肺水肿等，并能诱发大鼠肝癌，与我国和南非部分地区高发的食道癌有关。对人、畜是一种致癌物。玉米赤霉烯酮首次从玉米赤霉病病粒中分离到此毒素。禾谷镰刀菌也产生此种毒素。主要污染玉米、小麦等谷物。主要作用于生殖系统，具有雌性激素作用，妊娠期动物食用含此毒素的食物可引起流产、死胎和畸胎。还可引起神经系统的中毒症，如恶心、发冷、头疼等。真菌毒素毒素检测方法免疫分析法仪器分析法化学分析法生物鉴定法检测方法需要使用剧毒的黄曲霉毒素M1作为标定标准物，对操作人员造成巨大的沾污危险，而且黄曲霉毒素M1标准物质购买十分困难。操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大。仪器设备昂贵、笨重、操作复杂，难以实现现场快速分析。灵敏度较差，重复性很难得到满意结果。特点薄层层析法（TLC）原理:样品经提取、浓缩、薄层分离后，在365nm波长的紫外光照射下,黄曲霉毒素B1、B2产生紫色荧光,G1、G2产生绿色荧光。特点：灵敏度低，定量困难。高效液相（HPLC）法主要用荧光检测器检测，在适宜的流动相条件下，采用反相C18柱作为固定相，使多种毒素同时得到分离。原理:以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。高效液相（HPLC）法抗原：进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗体：抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。免疫学技术基本概念金标试纸法胶体金，也称金溶胶，是金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。胶体金胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共价结合，形成胶体金标记物。衬板样品垫金标垫吸收垫膜胶体金免疫层析试纸条的构成夹心法反应原理C阴性B阳性GICA有三种反应模式：夹心法，间接法，竞争抑制法。金标试纸法金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法,可一步式检测AFT。对黄曲霉毒素定性检测准确度在85%以上,灵敏度为4ng/mL。定义：用酶标记抗原或抗体检测液体中未知抗体或抗原的方法。酶联免疫吸附法(ELISA)酶联免疫吸附法原理：利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接。通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗原也可以是抗体。1、将已知抗体吸附于载体上2、温育后清洗3、加入可能含特异性抗原的待检液和酶标记的已知抗原液4、温育后清洗5、加入酶作用底物6、测定颜色反应深浅(分别测定两管的吸光度值，计算标本中待测抗原含量)酶联免疫吸附-竞争法固相抗体EEE酶标抗原待测抗原E底物E显色反应（弱）固相抗体EEE酶标抗原底物显色反应（强）EEEEEE双抗体夹心法基本工作原理：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗体免疫复合物。获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定免疫亲和柱法-最新国标法该法可以采用配套的荧光仪进行检测，也可以和高效液相色谱法结合，解决标准物污染和操作过程繁复等问题。免疫亲和柱法该种方法有着较好的权威性和通用性，且为国外多个组织认可，被列为标准方法，如：美国公职分析化学家协会（AOAC）美国农业部联邦谷物检测中心（FGIS）、国际纯粹与应用化学协会（IUPAC）、美国食品药品行政署（US-FDA）、美国农业部（USDA）在国内被认证的机构：中国出入境检验检疫局（CIQ）、中华人民共和国国家标准（GB）免疫亲和柱法认证机构广泛，通用性强。分析速度快，一个样品只需10－15分钟。灵敏度高，测定范围广泛（0－300ppb）,用荧光计可以测定0.1ppb的黄曲霉毒素M1，用HPLC可以检测出10ppt的黄曲霉毒素M1。采用单克隆免疫技术，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强。仪器轻便容易携带，自动化程度高，操作简单，直接读出测试结果，对实验操作人员要求不高，可以在小型实验场所使用。不需要标准物来标定，绝对安全可靠。原理利用抗原与抗体的高亲和力、高专一性和可结合的特点以及色谱技术的差速迁移理论而建立的一种新型色谱技术。就是将被测物的特异性抗体固定在适当的固相载体上，制备成免疫亲和色谱的固定相（免疫亲和色谱柱），根据被测物的反应原性、抗原抗体结合的特异性记忆，抗原抗体复合物在一定条件下能够可逆解离的特性进行色谱分离。免疫亲和柱特点：分离效率高，成本高，而且蛋白质亲和配基不稳定，容易降解。免疫亲和色谱过程目标蛋白质抗体制备介质制备上样与洗脱样品几种黄曲霉素检测方法的特点作业1什么是毒素?自然界毒素包括哪些?2什么是酶联免疫吸附法?简要说明酶联免疫吸附