医学微生物学实验指导

1医学微生物学实验指导西安交通大学医学院微生物学教研室2第一次实验课内容实验内容1.实验目的与要求实验内容2.实验室规则实验内容3.细菌形态学观察技术实验内容4.染色标本的制备—革蓝染色实验目的与要求医学微生物学实验课是该专业课程的重要组成部分，指导学生上好实验课是教学过程中的重要环节，学习实验课的目的是：1.使学生加深理解并巩固理论知识，学习和掌握有关的实验操作技术，为以后的医学专业课学习打好基础：2.在实验中，培养学生观察、思考和分析问题的能力，主动参与实验的动手能力及独立工作的能力。训练学生严格的科学作风、严肃白的科学态度和严密的工作方法。3.培养学生在集体工作环境中互帮互让，团结协作，共同完成好实验的精神品德。为了达到上述目的，提高实验课的教学效果，特提出以下要求：1.实验课前做好预习，明确本次实验课的内容及其原理、方法及注意事项；2.实验中要仔细认真，注意分工与协作，操作实验要按操作步骤进行。学会正确操作手法、准确记录实验结果。示教实验要注意观察，并记录好相关内容；3.详细讨论实验结果，提倡同学之间互帮互学，并紧密联系理论课内容。要注意不论实验结果与理论符合与否，都有讨论的价值，并分析其原因，有可能的话还应重复实验；4.严格遵守实验室规则，在微生物学实验课上，要树立“有菌观点”，严格掌握和不断完善无菌操作技术。3实验室规则一、进入实验室须穿工作服、戴工作帽。除必要的书籍文具外，其它个人物品一律不得带入实验室。二、在实验室内，禁止饮食、吸烟及与学习无关的其它活动，不得大声喧哗或嘻戏。三、未经老师许可，不得擅自搬动实验器材及示教物品，不准随意摆弄和旋转实验仪器上的开关及旋扭等。四、按照实验要求，在老师的指导下，主动安排要进行的实验，认真进行实验操作，严格遵守无菌操作规程，争取顺利地完成实验。五、实验中使用完毕的器材和试剂，必须放回规定的位置。废弃物必须按规定进行处理或归放于指定的容器内，不能随便乱丢乱放。六、实验中万一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情况，应及时报告老师进行处理，切勿自作主张不按规定处理。七、爱护实验室内一切设备、挂图、仪器。注意节约使用消耗材料及药品试剂，注意用电安全及节约水电。八、实验结束，要清理桌面，将实验器材放回原处。值日同学要搞好实验室的清洁卫生，保持室内整齐，离开实验室前要关好门窗、水、电，并将手洗干净。九、未经许可，不得将实验室内任何物品带出实验室。4实验一细菌形态学观察技术将细菌培养物或含菌标本材料制备的染色标本片，置显微镜油镜头下，可以观察到细菌的形状、大小、结构、排列及染色特性等，了解这些特征有助于鉴别各种细菌。一、显微镜油镜头的使用与保护【使用原理】用油镜观察标本、是在使用高倍镜的基础上，采用同玻璃折光率相似的油状物（如香柏油、液体石腊等），滴加在标本与油镜头中间，以避免光线散射，提高显微镜的清晰度和分辨能力。使观察物象更加清楚明了。【操作方法】1.调试：打开电源，先采用低倍镜，使视野达到清晰光亮。2.加油：双手向上转动粗螺旋，使镜筒上升，将标本片固定于载物台上，使染色面对准集光器央，加镜油于标本面，调换油镜头对准标本面。3.调焦点：用左手向下轻转粗螺旋，使镜筒下降，同时眼睛从右侧观察下降程度，待镜头入油后接触上玻片，用眼观目镜，反转粗螺旋，使镜筒慢慢上升，待看到模糊物象时，改用细螺旋上下调节，使物像达到完全清晰为宜（一般转动细调节前后半圈）。4.观察：观察时只使用细调。需改换视野时，右手操纵推进器，左手转动细螺旋，做到配合自如。并养成左眼观察，右眼绘图的习惯。【油镜头的保护】油镜头使用完结后，必须用擦镜纸滴加少量二甲苯将油擦洗干净（二甲苯用量宜少，以免镜片间粘胶溶解）。下降集光器，半接物镜转成“八”字，再下降镜筒，轻触镜台表面，双手平持显微放入镜箱，避免直射日光，置于干燥处，以防受潮。【注意事项】1.使用直筒显微镜观察标本时，必须两眼同时睁开，训练使用左眼观察，右眼绘图。如用油镜头观察，勿将镜身歪斜，避免镜油流出片面。2.观察染色标本时，光线宜强，可上升集光器，开大光圈。观察不染5色标本时，光源宜弱，可下降集光器，缩小光圈。3.使用完毕，一定擦去镜油。二、细菌不染色标本不染色的细菌和标本镜检，虽可观察细菌在自然生活状态下的大小、形态、活动等，但主要用于观察细菌的动力。（一）悬滴法【材料】1.细菌：枯草杆菌8~12小时肉汤培养物。2.凹玻片，盖玻片，凡士林等。【方法】1.取凹玻片一张，于凹窝周围涂少许凡士林（见图1）。图1悬滴法2.用接种环沾取枯草杆菌8~12小时培养物，置于盖玻片中央。3.反转凹玻片，使凹窝对准盖玻片中央，盖于其上，轻压后，迅速翻转玻片，使盖破片面向上。4.标本片置于显微镜载物台上，先用弱光线，低倍镜找物象，再改换高倍镜观察，密切注意，勿压破盖玻片。5.观察：细菌在镜下为灰色半透明体，并呈现真运动，如在明亮的海洋中，深入浅出游来动去。（二）压滴法用途同悬滴法。【材料】1.细菌：枯草杆菌8~12小时肉汤培养物。62.载物玻片：盖玻片等。【方法】1.取无油污物玻片1张。2.用接种环沾取枯草杆菌8~12小时肉汤培养物置于载物玻片中央。3.加盖玻片于菌液表面，观察方法同悬滴法。三、细菌染色标本片的制备（操作）由于细菌个体微小，基本上无色透明，故将其用适当染料染色观察，方能显示它的形态、大小、构造及染色特性等，在细菌和鉴别上有重要意义。【材料】1.葡萄球菌大肠杆菌18~24小时普通琼脂斜面培养物。2.革兰染色液。3.生理盐水，载物玻片，接种环等。【方法】（一）细菌涂片的制作1.涂片：取清洁无油污载物玻片一张，接种环沾取生理盐水1~2环置于玻片中央，再将接种环火焰灭菌待冷后，沾取葡萄球菌或大肠杆菌菌苔少许，混于生理盐水中，轻轻涂成均匀薄膜。2.干燥：室温自然干燥，也可将涂面向上，远离火焰上方微加温干燥（切勿加热过度，以防将标本烧枯）。3.固定：标本干燥后，通过酒精灯火焰三次（约2~3秒钟），以杀死细菌并使之固定于玻片上。4.染色：可根据不同的染色要求，用相应染色液进行染色。（二）革兰染色法：涂片的制备方法同前，革兰染色方法可分为四步。1.初染：于涂抹面上滴加结晶紫染液数滴，覆盖整个涂面，室温作用一分钟。用自来水轻轻冲洗，甩干水分。2.媒染：滴加鲁戈碘液，室温作用一分钟，自来水冲洗，甩干水分。3.脱色：将载物玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，边提边看，见涂面无色素下流为止（约30秒钟）。自来水冲洗，甩干水分。4.复染：加稀释复红染液染30秒钟，自来水冲洗，吸水纸吸干玻片水分。5.加油镜检：染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫色的为革7兰阳性菌，呈红色的为革兰阴性菌。（三）美兰染色法【方法】将涂片固定滴加美兰染液于玻片上，染1~2分钟，水洗、待干、镜检。【结果】此法为单染色法，菌体和细胞均染成蓝色。常用于脑膜炎球菌及白喉杆菌等细菌染色。四、细菌基本形态和特殊结构观察（一）基本形态（示教）1.球形：葡萄球菌革兰染色标本片——菌体正园形，染成兰紫色，呈现葡萄串状排列。G+球菌。2.杆形：大肠杆菌革兰染色标本片——菌体短杆状，染成红色，呈分散排列。G-杆菌。3.螺形：霍乱弧菌革兰染色标本片——菌体弧形，染成红色，呈分散排列。G-弧菌。（二）特殊结构示教1.鞭毛：伤寒杆菌鞭毛染色片——菌体较粗大杆状，染成兰灰色，单个或成堆存在，周围可见到波浪状弯曲、较长、呈兰灰色的鞭毛。2．荚膜：肺炎双球菌荚膜染色片——视野背景为红色，其中可见到染色呈深红色，矛头状菌体，纵向成双排列，菌体周围有未染上颜色的空白区，即荚膜。3.芽胞：破伤风梭菌芽胞染色片——菌体为细长杆状，顶端有染成红色、并大于菌体的球状物即芽胞，呈“鼓槌状”，其他散乱分布的红色球体，为菌体脱落的成熟芽胞。《附录》革兰（Gram）染液的配制1.结晶紫染液将1份结晶紫酒精饱和液与4份1%草酸铵水溶液混合即成（14克结晶紫加95%酒精100毫升即为酒精饱和溶液）。2.鲁戈（Lugol）碘液碘1克碘化钾2克蒸馏水300毫升83.稀释复红液1份硷性复红饱和液（硷性复红3.2克溶于95%酒精100毫升中。即为硷性复红饱和溶液）加9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸复红染液（抗酸染色用），取1份石炭酸复红染液加9份蒸馏水即为稀释复红染液。第二次实验实验内容1；细菌培养技术（操作）实验内容2；细菌的生化反应检测（示教）实验内容3：播放录象—《细菌感染的检查方法和防治原则》实验二细菌培养技术给细菌提供适宜的条件，细菌即可以生长繁殖，形成具有一定特征的培养物，学习细菌培养技术可以纯化细菌，了解细菌的生长特征，并能进一步检测细菌生化反应、变异性，制备细菌抗原，深入进行分子生物学工作等。了解细菌的培养特征也有助于鉴别细菌。细菌培养基的制备培养基是用人工方法将适合细菌生长繁殖的各种营养物配制而成的营养基质，以供细菌培养使用。一般培养基的主要成份为蛋白质、糖类、盐类、水分等。另外还有一些营养要求较高的细菌，还必须加入血液或血清、鸡蛋、维生素等其他营养物质。有时为了鉴别或抑制某些细菌，则可加入各种专用基质（如某种糖类、氨基酸等），指示剂，染料等。由于对培养基的使用目的不同，故在培养基的选择上有所不同。按其物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。按其成分和用途可分为普通培养基，鉴别培养基，选择培养基和专用培养基等。培养基需加入小试管、中试管、三角瓶、平皿等内使用。培养基的种类很多，但一般制备原则有三条：1.足够和适当的营养成份。籍以满足细菌生长繁殖的要求，获得典型细菌培养物，达到研究细菌的形态，生化反应，抗原结构及致病力等方面的目的。2.合适的酸硷度。培养基的酸硷度直接影响细菌的生长繁殖。一般细菌最合适PH为7.2~7.6。测定的方法常用普通比色法或精密PH试纸来测定（见附录）。93.绝对无菌。培养基务必进行除菌处理，由于培养基所含成份不同，除菌的方法也不同。如普通培养基常用高压蒸气灭菌法。一、常用培养基的制备（一）普通肉汤培养基【材料】1.新鲜牛肉或牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，蒸馏水。2.酚红指标剂，比色架及标准比色管或精密PH试纸。3.漏斗，量筒，三角烧瓶，试管等。【方法】1.称取去脂去腱绞碎的鲜牛肉500克，浸于1000毫升蒸馏水中，冰箱过夜，次日煮沸30分钟，纱布过滤，蒸馏水补足其量，（也可用牛肉膏3克加蒸馏水1000毫升加热溶化），即为肉浸液。2.取肉浸液1000毫，氯化钠5克，蛋白胨10克混合加热溶化。3.调整PH为7.6，用滤纸过滤分装于中试管或三角烧瓶内，塞紧棉塞。【用途】供基础培养基用，营养比肉膏汤好，一般营养要求不高的菌均可生长。（二）普通琼脂培养基琼脂是石花菜等海藻类提取的胶体物质，其化学成份主要是多糖。当温度达到98℃以上可溶解于水，45℃以下则凝固。琼脂对细菌一般无营养作用（除自然界中极少数菌可利用琼脂之外），纯属赋形剂。便于人们制做斜面、平板、高层等不同类型的固体培养基。【材料与方法】普通肉汤培养基100毫升，加入琼脂2~3克，加热溶化，用蒸馏水补足失去水分，调整PH为7.6后分装中试管、平皿等器皿，高压蒸气15磅灭菌20分钟，可制成普通琼脂斜面和普通琼脂平板。【用途】供一般细菌培养用，并可作无糖基培养基。（三）半固体培养基【材料与方法】取普通肉汤培养基100毫升，加入琼脂0.5~0.7克，加热溶化。调整PH为7.6，分装于小试管内，每管1~5毫升，高压蒸气磅灭菌20分钟，待冷后放入4℃冰箱10备用。【用途】保存一般菌种用，并可观察细菌的动力及生化反应。（四）血液琼脂培养基【材料与方法】将高压灭菌后普通琼脂培养基。冷至45℃~50℃时以无菌手续操作加入5%~10%血液（人或动物脱纤维无菌血液）。可制成血平板和血斜面。【用途】供营养要求较高的细菌分离培养用，亦可观察细菌的溶血特征。二、细菌接种技术及生长表现由于细菌感染而致病的各种标本及带菌者所需检查的各种标本，往往并非单一的细菌，而混有其它非致病菌（人体正常菌群）。因此当对此标本须作出细菌鉴定时，就必须从标本中分离出致病菌，称为细菌分离培