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1医学微生物与免疫学实验指导主编韩莉副主编王嘉军吴红艳编者（以姓氏笔画为序）王磊王嘉军刘英吴红艳杨建林周永芹张颖张丽红宋银宏邹黎黎韩莉柳长柏三峡大学医学院生物病原部20012年5月29日2前言本教材由医学微生物学和医学免疫学两部分组成，通过实习课教学使学生了解和掌握医学微生物学、医学免疫学的基本实验技能操作和基本研究方法，同时也能获取相应的感性知识。为培养学生的思维能力和独立操作能力，在进行设计性实验课教学时，学生也能利用本实习指导作为工具，顺利地进行实验操作，以节省学生获取知识的时间。为此目的，对每项实验的目的及实际意义都有所交代，对实验结果的观察与分析，也予以必要的辅导。限于教学时数和条件，有些内容将以示教、电视或电影教学方式教学，这部分尤其需要加强复习，以弥补未能亲自操作之不足。有关实验课的改革设想，仍须不断地接受实践考验，发扬成绩克服缺点，以不断地充实和提高。为了提高实验课效果，保证实验课质量，要求学生做到：1．实验前必须做好预习，以了解实验的内容、目的、理论依据、操作方法及注意事项，避免或减少错误的发生。2．实验过程中坚持严肃性，严格性与严密性，对操作的实验要在全面理解的基础上，按步骤依次进行操作，进行积极地思考；对示教内容要仔细观察并与有关理论密切联系。3．如实记录，分析结果，得出结论。如结果与理论不符，应尽量分析，探讨起原因以培养训练自己的思维能力，最后写出实验报告。4．实验报告中部分内容需要绘图，其具体要求如下：（1）必须在认真观察多个标本并基本掌握所观察标本的典型结构之后再绘图。（2）绘图要用规定的报告纸和铅笔画点线构成的轮廓图（部分绘图用彩色笔）。（3）绘图时要线条清晰，注字准确清楚，并应向右侧指线。（4）要妥善处理同一标本各部层次及同类标本间大小，比例关系.将放大倍数写于图下编者2012年5月29日3内容简介第一篇医学微生物学医学微生物学实验是医学微生物学课程的重要组成部分，我们将医学微生物学实验课内容分为六个单元，改变以往单一的实验方式，在综合性实验的基础上开设设计性实验，学生能比较系统地了解常用微生物学实验的原理、方法、结果分析、注意事项及用途，可以帮助学生理解和巩固所学的理论知识，培养学生的操作技能以及观察问题，分析、解决问题的能力、严谨的科学态度，同时实验与病案讨论结合，学生能将理论知识与临床实践有机联系，为学习其它基础医学，临床医学及预防医学奠定基础，从而提高学生的综合素质。第二篇医学免疫学实践教学是课程建设的重要环节，培养和提高学生的综合素质与创新能力重要途径。在免疫学实验教学中我们大力改革实验教学的形式和内容，将免疫学的16学时实验内容分为两大部分，第一部分为综合性实验，包括了解天然免疫的组成与生物学功能的检测；常见体液免疫检测指标的设计，使学生能较熟练应用基本的免疫学实验技术，能针对不同的临床病例开展相关免疫学项目的基本检测，并对检测结果进行合理的临床解释和分析。为了学生既能适应一般临床与科研工作，又具有一定的创新工作能力。第二部分我们开设设计性实验：市场有某一生物制剂有免疫增强作用，请设计实验方案证实。在这部分内容要求同学们初步掌握从不同角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计，掌握与了解常见细胞免疫的检测技术和应用（ELISA检测细胞因子）、免疫标记技术的种类、原理、特点、应用、淋巴细胞分离记数技术、淋巴细胞增殖等实验。4目录第一篇医学微生物学实验室规则………………………………………………………………………6实验一常见细菌形态学检查方法（综合性实验）…………………………7实验二细菌的分离培养法与消毒灭菌（综合性实验）……………………15实验三化脓性球菌的分离鉴定（设计性实验）……………………………30实验四肠道杆菌的分离鉴定（设计性实验）………………………………34实验五厌氧菌、分支杆菌的检查法（综合性实验）………………………43实验六真菌及其它微生物检测（综合性实验）……………………………49实验七病毒学检查法（综合性实验）………………………………………49实验八微生物学分子生物学技术微生物学各论自学提纲…………………………………………………………59第二篇医学免疫学实验一天然免疫功能的检测（综合性实验）…………………………………60实验二常见抗原抗体反应（综合性实验）……………………………………67实验三细胞免疫检测I：细胞因子的检测（设计性实验）……………………86实验四细胞免疫检测II：淋巴细胞分离、计数及活性检测（设计性验）…………………………………………………………………………………96实验五细胞免疫检测III：淋巴细胞增殖实验（设计性实验）……………105综合复习………………………………………………………………………104附录……………………………………………………………………………1155实验室规则由于实验对象主要是病原微生物，进入实验室必须严格遵守下列规则：一、必须穿工作服（白大褂）才能进入实验室，除必要的书籍、文具外，其它杂物不得带入室内，离室时脱下的白大褂折叠好。二、实验室内不准吸烟、饮食，不准口吸移液管或用嘴湿润铅笔、标签等。实验室要保持肃静和秩序，不得高声谈笑和随处走动。三、实验室中若不慎发生病菌污染桌面、衣物、伤口等意外，请报告指导教师进行适当处理，微生物学实验室意外的紧急处理办法：1．皮肤破损：先除去异物，用生理盐水或蒸馏水洗净后，涂2%红汞或2%碘酊。2．烧伤：局部涂凡士林、5%鞣酸或2%苦味酸。3．化学药品腐蚀伤：强酸--先用大量清水冲洗，再用碳酸氢钠溶液洗涤中和。强碱--先用大量清水冲洗，再用5%硼酸溶液洗涤中和。如受伤处为眼部，经上述步骤处理后，用橄榄油或液体石蜡1～2滴滴眼。4．菌液误入口中：立即将菌液吐入消毒容器内，并用1：1000高锰酸钾液或3%双氧水漱口；根据菌种不同，服用抗菌药物预防感染。5．菌液污染桌面：将适量2～3%来苏或0.1%新洁尔灭倾倒于污染处，浸泡30分钟后抹去。如手上沾有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后，再用肥皂和清水洗净。6．火警：如发生火警时须沉着、冷静，切勿惊慌，应立即关闭电闸和煤气阀门。如为酒精、乙醚、汽油等有机溶液起火，切忌用水扑救，可用沙土等扑灭。四、请爱护、节约实验材料，若有损坏应报告教师，适当赔偿。五、沾染过传染材料的吸管、滴管、玻片等不要乱放乱动，须按规定处理，未经许可室内物品不得携出室外。六、实验完毕，及时清理实验室，肥皂、清水洗手；值日生打扫室内卫生，关好水电、煤气、门窗、肥皂、清水洗手后离室。6实验一、常见细菌形态学检查方法（综合性实验）【实验内容】一、细菌涂片制作及革兰氏染色法。二、细菌的基本形态与特殊结构观察。三、细菌动力的观察（悬滴法）。四、显微镜油镜的使用和维护。五、电镜观察细菌的菌毛。【目的要求】一、初步掌握细菌涂片制作过程及革兰染色的操作技术。二、认识细菌基本形态。三、了解细菌特殊结构及其与医学实践关系。四、初步掌握油镜的使用和维护。五、了解电镜在医学微生物学研究中的应用。【实验原理】一、革兰染色法细菌染色法是细菌形态学检查的一项基本技术。由于细菌个体微小，无色半透明，在普通光学显微镜下不易清晰观察，一般需经染色来增加反差，从而有利于对细菌标本的观察。染料有带阴离子着色基团的酸性染料和带阳离子着色基团的碱性染料。在一般生理条件下（pH7.4左右），细菌菌体都带负电荷，故用于细菌染色的染料多为带阳离子着色基团的苯胺染料，如美蓝、结晶紫、碱性复红等，它们较易与细菌菌体结合。染色方法可分单染色法和复染色法两大类。前者只用一种染料染色，只能观察细菌的形态和排列，不能显示细菌结构及染色反应性；后者是以两种以上的染料染色，可显示出细菌的特殊结构或染色反应性能，在细菌的鉴别上有一定意义，其中最常用的为革兰染色法。细菌革兰（Gram）染色是最常用的细菌鉴别染色法，首先由Gram创用而得名。细菌染色后不仅可区别其形态和排列方式，还可根据染色结果将所有细菌分成革兰阳性菌与革兰阴性菌两大类；不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌（G+菌），被酒精脱色后复染成红色者为革兰阴性菌（G-菌）。革兰染色法不仅有助于细菌的鉴别，同时还为分析细菌的致病性和选用抗菌药物提供了依据。革兰染色的原理目前存在三种假说：1．通透性学说革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。2．等电点学说革兰阳性菌等电点（pI2~3）比革兰阴性菌（pI4~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。73．化学学说革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。在细菌标本染色前，必须将细菌固定在载玻片上，常用的固定方法为加热法，其目的是杀死细菌，且保持原有形态，并使细菌粘附在载玻片上，不致染色时脱落。二、细菌的基本形态和特殊结构观察1、油镜用油的原理观察细菌形态，需要放大，过去的实验课观察标本时，多用低倍镜、高倍镜放大。观察细菌标本时，必须用放大倍数更高的油镜才能清楚地看到细菌形态特点。因之微生物学实验主要使用油镜。油镜的特点是前透镜很小，油镜头的标记也因厂牌不同而异，一般多刻有放大率。如(90×，100×)，镜口率(N.A=l.25或1.30),Oil,国产镜头刻“油”字等。油镜可以使标本放大1000—2500倍，研究细菌形态必须用油镜。油镜观察时，在标本与镜头之间必须滴加镜油，否则视野不清。原因是油镜前透镜很小，光线通过玻片标本后在空气中发生折射，进入镜头的光线少，致使视野暗物象不清。如在标本与镜头间加一滴（切勿散开）与玻片折光率(N=l.52)相近的香柏油（N=l.515）则进入镜头的光线增多，视野明亮物象清晰(图2)滴油又能增加油镜孔径数值，提高显微镜的分辩率等。2、细菌的基本形态和特殊结构细菌的基本形态可分为球菌、杆菌和螺形菌三类。球菌按其分裂繁殖方向与分裂后排列情况又分为双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等；杆菌也有球杆菌、链杆菌、分枝杆菌、棒状杆菌等之分；螺形菌中菌体仅有一个弯曲，呈逗点状者叫弧菌，玻片透镜香柏油图-2油镜的原理8菌体有2～3个弯曲，且较僵硬者为螺菌。某些细菌除了有细胞壁、细胞膜、细胞浆和核质这些基本结构外，还具有其他特殊结构，包括荚膜、鞭毛、菌毛和芽孢。这些特殊结构有着各自的不同意义。三、细菌动力的观察（悬滴法）许多杆菌、弧菌具有鞭毛，有动力，在液体中能从一个地方较快速地移动到另一个地方。一般球菌无鞭毛，没有动力，但受到所处环境中液体分子的冲击而仅呈位置变更不大的颤动。四、电镜观察细菌的菌毛电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示。20世纪70年代，透射式电子显微镜的分辨率约为0.3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米)。现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍，而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍，所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子。【实验材料与仪器】一、无菌牙签、革兰染色液（结晶紫染液、碘液、95%酒精、复红染液）、生理盐水、载玻片、冲洗用具等二、普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸三、球菌、杆菌、螺形菌及特殊结构示教片四、葡萄球菌、变形杆菌幼龄（8～12小时）肉汤培养物、凹玻片、盖玻片、凡士林等五、电镜H-7500，放大倍数20～60万倍，最大分辨能力0.204nm【实验方法与步骤】一、细菌涂片制作及革兰氏染色法1．制片：⑴涂片：取清洁玻片一张，在玻片的中央滴一小滴生理盐水（滴加生理盐水不宜过多）。用无菌牙签挑取牙垢少许，与玻片上的水滴混匀，涂布成一厘米大小的均匀薄膜。⑵干燥：将涂片放室温中自然干燥，切勿紧靠火焰烘烤，以免标本烤焦，损害菌体结构。⑶固定：持玻片一端，标本面向上，迅速通过火焰