大学教程DNA生物合成

第八章核酸的生物合成本章重点介绍遗传中心法则和DNA、RNA的生物合成，对基因工程作一般介绍。DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。中心法则(Centraldogma)蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。目录第四节基因工程及分子生物学技术简介第一节DNA的生物合成第二节RNA的生物合成第三节核酸合成的抑制剂第一节DNA的生物合成一、DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）三、DNA突变四、DNA的损伤与修复二、逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成）第一节DNA的生物合成复制：遗传信息从亲代DNA传递到子代DNA分子上。2/62一、DNA半保留复制(SemiconservativeReplication)定义：子代DNA双链中的一条链来自母链，另一条链重新合成。母链子链3/62(深蓝:15N)(粉红:14N)DNA半保留复制的证据培养于普通培养液继续培养于普通培养液含15N-DNA的细菌普通DNA重DNA第一代中等密度DNA第二代普通DNA中等密度DNA4/62半保留复制的意义：遗传稳定性的分子机制。但是：遗传稳定性是相对的，生物界存在普遍的变异现象基因表达：包括转录和翻译6/62二、DNA复制的酶学1.底物：dATP，dGTP，dCTP，dTTP，总称为dNTP2.DNA聚合酶，DNA-pol3.模板（template）：解开成单链的DNA母链4.引物（primer）：RNA引物5.其他酶和蛋白质因子7/62一）复制的化学反应5`3`3`5`磷酸二酯键的生成3`5`N1OH3`5`+dN2TPN1N2-OH3`5`+PPi8/62DNApol二）DNA聚合酶（DNApolymerase,DNA-pol）即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）真核生物有多种：DNA-pol、、、、…原核生物有3种：DNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ9/62表13-1大肠杆菌中DNA聚合酶某些性质DNA-pol性质ⅠⅡⅢ酶分子/细胞4004020活性（nt/min）1000501000005'→3'聚合功能有有有5'→3'外切酶活性有有无3'→5'外切酶活性有有有主要功能校读,修复不清复制填补缺口10/62’ThemodelofDNA-polIIIformthecatalyticcoreLinkstwocoresLeadingstrandsynthesisLaggingstrandsynthesisactasaclamp11/62小片段大片段（Klenowfragment）5‘→3’聚合功能，3'→5'外切酶活性5'→3'外切酶活性DNApolI12/62JHB真核细胞中DNA聚合酶种类：DNA-polα、β、γ、δ、ε…DNA-polα：合成随后链DNApolδ：合成先导链DNA-polε：校对，修复和填补缺口DNA-polγ:线粒体DNA复制DNA-polβ：功能不清13/62质粒与线粒体DNA是细胞核染色体外的遗传物质。能进行自我复制。质粒是基因工程的常用载体线粒体DNA(mtDNA)全长16kb，有37个基因，编码与ATP合成有关的酶和蛋白质。特点：1.母系遗传2.DNA损伤后不易修复3.遗传密码与通用遗传密码有差别14/62UGA（终止密码子）：TrpAGA/AGG（Arg）：终止密码子AUA（Ile）：Met（起始密码子）DNA-pol的5´3´聚合作用3’5’5’3’3’5’DNA-pol15/625’3’OHP3´5´外切5´3´外切5’3’内切酶（or限制性内切酶）5’3’3´5´外切5´3´外切外切酶与内切酶作用图解16/62DNA-polI5´3´外切酶活性的功能：切除引物，切除突变片段DNA-polI3´5´外切酶活性的功能：校读（proofread）功能5’3’AG5’3’17/62DNA复制的保真性(fidelity)1.严格遵守碱基配对规律2.DNA-pol在复制过程中对碱基的选择性3.复制出错时有即时的校读功能ATGCDNApolIII在催化磷酸二酯键形成之前完成对碱基的选择；对反式嘌呤核苷酸的亲和力较顺式的大。18/62三）复制中解链和DNA分子的拓扑学变化解链酶类：1.解螺旋酶(helicase)DnaB2.拓扑异构酶（topoisomeraseI、II）解旋酶，3.单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNA-bindingprotein,SSB)19/621.解链（螺旋)酶(helicase)解螺旋酶作用：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链。ATP20/622.拓扑异构酶（topoisomerase,Topo）拓扑(topology)与拓扑异构DNA正超螺旋与负超螺旋负超螺旋正超螺旋DNA双螺旋拓扑异构酶21/62切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA分子成负超螺旋再连接切口。不需ATP，切割双链DNA中的一链，使DNA松弛后,连接切口。TopoⅠ:TopoⅡ:临床上使用的某些抗肿瘤药（如喜树碱，鬼臼乙叉甙等）是通过抑制Topo酶活性而杀死肿瘤细胞的。22/62Topo酶：切割DNA链，使其松弛后再连接。3.单链DNA结合蛋白（singlestrandedbindingprotein，SSB）作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解。23/62四、引物酶(Primase)和引发体5´5´催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶。DNA合成需在RNA引物的基础上进行。5´3´5´3´24/62DnaA引发体（primosome）：包括解螺旋酶、DnaC、引物酶（DnaG）及DNA复制的起始区域。5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解螺旋酶25/62五、DNA连接酶(DNAligase)功能：催化DNA双链的3’羟基和相邻的5’磷酸基团形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。DNA连接酶ATPATP26/62参与DNA复制的主要成员主要成员主要作用DnaA识别复制起始位点解螺旋酶解开DNA双链SSB维持已解开单链DNA的稳定引物酶合成RNA引物TOPO使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰DNA-polⅢDNA复制DNA-polⅠ水解引物、填补空隙、修复作用DNA连接酶催化双链DNA中单链缺口的连接27/62三、DNA生物合成过程1.复制的起始2.链的延长3.复制的终止28/62SG1MG2蛋白质合成期DNA合成期哺乳动物的细胞周期29/62复制的起始(一)DNA解成单链由特定蛋白质识别复制起始位点（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉。30/62倒YE.coli复制起始点oriC跨度为245bp，有3组串联重复序列和2对反向重复序列。GATTNTTTATTT…GATCTNTTNTATT…GATCTCTTATTAG串联重复序列反向重复序列…TTTGGATAA…..TTATCCACAAATAGGT--TTGTGGATTA……TTATACACA…A--TA--GTGT31/62回文结构AGCTTCGA(二)引发体的生成解螺旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体。5´3´3´5´引物酶DnaC引发体解螺旋酶32/62（三）RNA引物的合成33/625´5´5´3´5´3´小节参与复制起始的成员名称功能DnaA蛋白辨认起始点解螺旋酶（DnaB，Rep）解开DNA双链DnaC协助解螺旋酶引物酶（DnaG）催化RNA引物生成SSB稳定解开的单链拓扑异构酶理顺DNA链OriCE.coli复制起始点34/62引物合成后，由DNApolⅢ（在真核细胞为DNA聚合酶和)催化，按碱基配对原则，将dNTP逐一添加到引物3’末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长。复制的延长3’——AAGACCTATT——5’5’——TTCTGGATAA——3’35/62dATP+DNApol36/62领头链（leadingstrand）随从链（laggingstrand）冈崎片段(Okazakifragment)37/62原核细胞DNA的半不连续复制复制过程复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5´RNA引物3´3´DNA连接酶复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物体引物体解链酶解链酶•DNA的复制过程：1.半不连续性：DNA复制过程中，一条链是连续复制，另一条链是不连续复制的现象。有关复制延长的几个重要概念4.冈崎片段（Okazakifragment）：不连续复制的片段3.随从链:链的延长方向(5’3’)与解链方向相反，为不连续复制。2.领头链:链的延长方向(5’3’)与解链方向相同,为连续复制。38/625.双向复制oriori6.复制子(replicon)oriori真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段。以起始点为中心，向两个方向进行复制。39/62滚环复制是某些病毒，质粒、线粒体DNA的特殊复制形式。40/62复制的终止•原核生物复制终止•真核生物复制终止41/621、原核生物DNA为环状，双向复制的汇合点就是复制终止点。原核生物复制终止2.领头链上的RNA引物被RNA酶水解后，由DNApolI催化，由新合成链提供-OH补齐。终点起点RNA酶DNApolI连接酶42/623、冈崎片段引物的消除和连接。RNA引物RNA酶DNApolIDNA连接酶43/62真核生物的端粒(telomere)和端粒酶(telomerase)真核生物DNA末端结构是端粒，在端粒酶的作用下形成。（TTAGGG）n44/62端粒酶：由RNA与蛋白质组成，具逆转录酶活性，以自身RNA为模板合成DNA。UUAA3’5’ACCAACCCGGGTTGGGT3’5’3’CCAACCGGGTTGGGTTGGUUAA3’5’3’5’3’ACCACCUUGGGTTGGGTTGGAA3’5’3’5’3’ACCABindingElongationTranslocationTelomerase45/62爬行模型：Inchworm（尺蠖）modelCACCUUGGGTTGGGTTGGAAAA3’5’3’5’3’ACCAElongationCACCUUGGGTTGGGTTGGAA3’5’3’5’PrimersynthesisCCCAACCCAACCUUGGGTTGGGTTGGAA3’5’3’5’PrimaseDNApolymeraseCCCAACCCAGGGTTGGGTTGGAA3’5’3’5’DNAreplicationPrimerremoval46/62真核和原核DNA细胞复制比较端粒酶使线形DNA分子的末端保持不变新合成链提供-OH补齐复制终止四、DNA损伤（突变）与修复DNA分子一级结构的改变称为DNA损伤(DNAdam