第15章 色谱分析法导论(S)

1第十五章色谱分析法导论15.1概述15.2色谱图及色谱常用术语15.3色谱分析的基本理论15.4色谱定性和定量方法215-1概述一、色谱法的由来与发展1.由来色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特(Tswett）分离植物色素时提出。Tswett在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各种组分互相分离，形成3各种不同颜色的谱带。在玻璃管上，每一种色带即为一种色素（完全分离）。色带犹如光谱分析中的谱线（带），因此得名“色谱法”。（chromatography）4名称：(1)固定相（stationaryphase）在色谱法中，填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）。(2)流动相（mobilephase）携带试样混合物流过固定相的流体（气体或液体）。(3)色谱柱（column)装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）5色谱法分离过程：当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两个重要特征：①试样中各组分在柱中不等速迁移（热力学因素）；②每种组分在流经柱子后发生谱带扩散分布（动力学因素）。62.发展（1）1901年，Tswett开始研究。（2）1903年3月21日，华沙自然科学生物学会论文：“一种新型吸附现象及其在生物分析上的应用”，提出用吸附原理分离植物色素。（3）1906年，德国生物学会议，公开展示“彩色环带的柱管”——“色谱图”。（4）在随后20多年中，色谱分离法得以广泛推广与应用，特别是在天然有机物的分7离与分析中。（5）1952年，Martin（英）发明了GL分配色谱—诺贝尔化学奖。（6）1954年，Ray发明了TCD检测器。（7）1956年，Van.Deemter（荷）提出速率方程理论。（8）1957年，Golay（美）发明了玻璃毛细柱（φ＜1mm）。（9）几年后，Mcwillian（澳）发明了FID。Lovelock（英）发明了ECD。8（10）60年代，各国相继出版了有关色谱教科书及专著—色谱成为一门独立学科。（11）1962年，超临界流体色谱技术—SFC（12）80年代，毛细管电泳色谱—CEC9•仪器的发展☆1955年，美国商品色谱仪出现；☆1957年，日本商品色谱仪出现；☆1960年，美国液相色谱仪，Waters☆1979年，“弹性石英毛细柱”；Golay柱（1957年）为易碎的玻璃柱，长8~10~100m；石英毛细柱φ0.1、0.22、0.32、0.53mm10●进口色谱仪器品牌有：HP（安捷伦）、Waters、岛津、戴安●国产仪器有：北分（SP）、上分、鲁南11二、色谱法分类1.按操作（固定相使用）形式分类（1）柱色谱：固定相装于柱内的色谱法。分为填充柱色谱和空心毛细管柱色谱。（2）平板色谱：固定相呈平板状的色谱。它又可分为薄层色谱（固定相压成或涂成薄膜的色谱）和纸色谱（固定相为滤纸的色谱）。122.按两相状态分类（使用最普遍）（1）气相色谱（GC）：流动相是气体的色谱。分为气固色谱（GSC）气液色谱（GLC）（2）液相色谱法（LC）：液体为流动相的色谱。分为液固色谱（LSC）液液色谱（LLC）超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SFC）。133.按分离机理分类（1）吸附色谱利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法。（2）分配色谱利用不同组分在固定液（固定相）中不同的分配系数而达到分离的方法。（3）离子交换色谱利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法。14（4）凝胶色谱（或空间排阻）色谱利用多孔性固定相对大小不同的分子的排阻作用而达到分离的方法。又称为空间（尺寸）排阻色谱法。15GC与LC的区别：①物质在GC中传输速度快，流动相渗透性好，可用长柱，分离效率高，分析速度快；但GC要求样品具有一定挥发性及热稳定性；气体价格低，仪器相对便宜。②LC的流动相为色谱纯液体，需用高压恒流泵传输，造价高，有机溶剂为流动相，价高、消耗量大，仪器昂贵，但只要样品具有一定的溶解性即可用LC分析。一般，GC可分析15%～20%的有机物；LC可分析70%～80%的有机物。1615-2色谱图及色谱常用术语一、色谱图—色谱流出曲线和色谱峰色谱柱后流出物通过检测器时，系统所产生的输出响应信号强度（R）对时间（tR）或流动相流出体积（VR）作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。响应信号—电压（mv）或电流（mA）17Y色谱图18二、色谱图基本术语1.基线在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。192.色谱峰组分浓度随时间变化的曲线。如果进样量很小，浓度很低，在线性范围内，则色谱峰是对称的。标准的色谱峰为正态分布曲线。每一色谱峰至少代表一个组分；每一峰的峰值出峰时间——定性；每一峰的峰面积（峰高）——定量。203.峰高h色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示。用纸高（mm）或电信号大小（mv或mA）表示。4.峰的区域宽度色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有三种方法。21①标准偏差即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半（即拐点峰宽的一半）。=½Y0.607h②半峰宽Y1/2即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为Y1/2=2.355③峰底宽度Y（基线宽度）即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差的关系是Y=422色谱流出曲线Y0.607h=2σY=4σY1/2=2.355σY≠2Y1/2235.峰面积A峰面积是色谱图提供的基本定量数据，峰面积测量的准确与否直接影响定量结果。对于不同峰形的谱峰采用不同的测量方法。（1）对称形峰面积的测量A=1.065hY1/2（2）不对称形峰面积的测量（3）剪纸称重法—原始色谱定量法0.85h0.15hYY21hYhA246.色谱保留值—各种组分在柱上的滞留情况（1）时间表示的保留值①死时间tM不被固定相吸附或溶解的物质（空气或甲烷）进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间。它正比于色谱柱的空隙体积。测定流动相平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算即ū=L/tM25②保留时间tR试样从进样到柱后出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间。③调整保留时间tR´某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的调整保留时间。即tR´=tRtMtR´：由于组分吸附或溶解于固定相中，比流动相在柱中多滞留的时间。tR：出柱时间；tR′：与固定相作用时间。26（2）用体积表示的保留值①死体积VM指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fo（cm3·min-1）计算。VM=tMFoVM反映了柱和仪器系统的几何特性，与被测组分的性质无关。27②保留体积VR指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。VR=tRFo载气流速越大，保留时间降低，VR不变—VR与载气流速无关。③调整保留体积VR某组分的保留体积扣除死体积后的保留体积。VR=VRVM=tRFo同理：VR与载气流速无关，并更合理地反映了被测组分的保留特性。287.相对保留值r2.1或ri.s某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比。r2,1=tR2/tR1´=VR2/VR1相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关。在色谱法中，特别是在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。相对保留值r2.1或ri.s也称为分离系数、柱的选择性、溶剂效率等。29在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，即=tR(i)/tR(s)式中tR(i)为后出峰的调整保留时间，所以总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子。当=1时，两组分永不分离；越大，分离的越好。30三、分配平衡★色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。★但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。31分配平衡：一定温度（TC）下，组分在流动相和固定相间作用达到的平衡。1.分配系数K指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即mSCCK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度32下图是A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。沿柱移动距离L溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓浓度ABKA＞KBAB33★分配系数的要点：①K值与组分性质、固定相性质、流动相性质、分离温度有关的参数；②一定TC下，K越大，出峰越慢；③提高TC，组分在固定相中浓度降低，tR变小；④K=0的组分，不被固定相保留，最先流出；⑤每个组分的K不同，选择适宜的固定相来改善分离效果；⑥试样中不同组分在相同分离条件下，K不同，得以分离。342.分配比k′（分配容量或容量因子）分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即β1KVVKVCVCkmmkmSmmSSms组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量35式中：①β为相比：反映色谱柱柱型及结构的参数。填充柱相比约6～35；毛细管柱的相比约50～1500。②，VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间空隙体积。VS为固定相体积，其中，GSC中为吸附剂表面容量，GLC中为固定液体积。③空气或甲烷的ms=0，∴k′=0SMVVβ363.分配比与保留值的关系1212M1M2R(1)R(2)2121MRKKkktktkttαrttk37讨论：①K和k′除与组分及固定相的热力学性质有关外，还随柱温、柱压的变化而变化。②K只与组分和两相性质有关，与两相体积无关。而k′又称容量因子、分配容量、容量比，其随固定相的量的增加而增大。③k′越大，保留时间越长。k′=0，tR´=0，tR=tM3815-3色谱分析的基本理论试样在色谱柱中的分离过程包括两方面：热力学—各组分在两相间的分配情况（tR由K决定）动力学—各组分在两相间的传质情况（Y1/2）一、塔板理论塔板理论：1941年，Martin提出的半经验热力学理论。——给出衡量柱效的指标39把色谱柱比作一个分馏塔，引入理论塔板数（n）作为衡量柱效率的指标，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。401.塔板理论的建立①在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。②以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。③所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。④分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。4142432.塔板理论的结论色谱柱长：L虚拟的塔板间距离：H色谱柱的理论塔板数：n（衡量柱效的指标）则三者的关系为：n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：2R21/2R)Yt16()Yt5.54(n44★有效塔板数和有效塔板高度单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：有效有效