第15章 色谱分析法导论

1第十五章色谱分析法导论§15-1概述§15-2色谱分离原理§15-3色谱法基本理论§15-4分离度§15-5气相色谱定性分析§15-6气相色谱定量分析2§15-1概述一、色谱法（Chromatography）利用样品在两相间的分配来分离、分析多组分混合物的技术。色谱法是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间作相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。31.色谱法的产生及发展色谱法是一种分离技术，它是俄国植物学家茨维特1906年创立的。分离植物叶子中的色素时，将叶片的石油醚（饱和烃混合物）提取液倒入玻璃管中，柱中填充CaCO3粉末（CaCO3有吸附能力)，用纯石油醚洗脱（淋洗）。色素受两种作用力影响。4（1）一种是CaCO3吸附，使色素在柱中停滞下来（2）一种是被石油醚溶解，使色素向下移动各种色素结构不同，受两种作用力大小不同，经过一段时间洗脱后，色素在柱子上分开，形成了各种颜色的谱带，这种分离方法称为色谱法。5固定相(stationaryphase):CaCO3颗粒流动相(mobilephase):石油醚6茨维特在当时的实验中观察到4个色带，它们分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A和B。随着被分离样品种类的增多，该方法广泛地用于无色物质的分离，“色谱”名称中的“色”失去了原有的意义，但“色谱”这一名称沿用至今。71906年茨维特在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法。1952年Martin和Synge因色谱的理论与应用研究获得诺贝尔化学奖。81952年，Martin和James发表第一篇气液色谱论文，首次用气体作流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的革命。VanDeemter等对色谱理论的研究极大地促使色谱技术的发展。1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立。91956年，荷兰的VanDeemter在总结前人工作的基础上提出速率理论。1957年戈雷(Golay)发表“涂壁毛细管气液分配色谱理论和实践”论文，实现了毛细管气相色谱分离。1979年弹性石英毛细管应用于气相色谱。80年代将固定液固载化是毛细管色谱技术的又一个重要发展。它大大提高了色谱柱的稳定性,延长了柱寿命,提高了色谱性能。10二.色谱法的分类1.按两相所处的状态分类气相色谱(GC)液相色谱(LC)按流动相的状态分类适用于气体和低沸点有机化合物的分析，仪器简单，操作方便，应用广泛。可在不同操作温度条件下使用。11按固定相不同又分为气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)液相色谱液固色谱(LSC)液液色谱(LLC)适用于高沸点、不易气化的、热不稳定及生物活性物质的分析，通常在室温条件下工作。12色谱法液相色谱法气相色谱法气-液色谱法气-固色谱法液-固色谱法液-液色谱法132.按固定相所处的外形分类平板色谱填充柱色谱毛细管柱色谱薄层色谱和纸色谱柱色谱3.按组分在两相间的分离机理分类吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、空间排阻色谱、毛细管电泳1415三、色谱法的特点1.分离效率高复杂混合物、性质相近的有机同系物及旋光异构体等。对于那些性质极为相似的组分,如同位素、同分异构体,采用高选择性固定相，使它们之间的分配系数产生足够大的差异,从而实现良好分离。16多种高灵敏检测器，痕量杂质分析的有力工具。可以检测出ppt(10-9)级甚至ppb(10-12)级。2.灵敏度高174.应用范围广可分析有机或无机的气、液、固体试样组分的定性较为困难缺点：3.分析速度快解决方法：发展联用技术18四.气相色谱分析法与其它方法比较1.气相色谱法与分馏法的比较色谱分离比分馏快，得到的物质纯度比分馏法高。石油化学家采用分馏法花了20多年才鉴别出石油中的200余种组分，而当今采用毛细管GC仅需数小时即可完成。19苯和环己烷的沸点仅差0.6℃，如用精馏分离柱进行分离是不可能的。环己烷苯202.气相色谱法与经典化学分析的比较化学分析根据物质具有某种独特的化学性质来进行测定,而色谱分析能使许多化学性质相同/相似的复杂组分相互分离后测定。3.气相色谱法与光谱、质谱分析法的比较光谱、质谱主要是定性分析工具,色谱是分离分析的工具。色谱法的最大优越性在于它最擅长分离分析多组分的复杂体系。21§15-2色谱分离原理热力学因素：分配系数动力学因素：组分在色谱柱的扩散和传质22色谱分离过程简述在色谱分析中，当流动相携带样品通过固定相时，样品分子与固定相分子之间发生相互作用，使样品分子在流动相和固定相之间进行分配。与固定相分子作用越大的组分向前移动越慢，与固定相分子作用越小的分子向前移动速度越快，经过一定距离后，由于反复多次的分配（柱色谱为103～106次），使原本性质（沸点、极性等）差异很小的组分之间也可得到很好的分离。23分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异微小差异积累→较大差异→作用能力弱的组分先流出；作用能力强的组分后流出24一、分离原理固定相是多孔性的固体吸附剂颗粒，其分离是基于固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同；1.气固色谱:25固定相由担体和固定液所组成，固定液涂敷在担体表面，其分离混合物是基于固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。2.气液色谱:26试样中的各组分K值不同是分离的基础二、分配系数和分配比1.分配系数K(distributioncoefficient)在一定温度和压力下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数。一定温度和压力下，K越大，出峰越慢MSCCK272.分配比k(distributionratio)在一定温度和压力下，组分在两相间分配达到平衡时，分配在固定相和流动相中的质量之比。MSmmk28k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也取决于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。293、分配系数和分配比之间的关系分配系数K与柱中固定相和流动相的体积无关，而取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。容量因子k决定于组分及固定相的热力学性质，随柱温、柱压的变化而变化，还与流动相及固定相的体积有关。30理论上可以推导出：Phaseratio(相比，b):反映各种色谱柱柱型及其结构特征填充柱（Packingcolumn）:6~35毛细管柱（Capillarycolumn）:50~1500bkVVkVmVmCCKSMMMSSMS31三、气相色谱流出曲线1.基线(baseline)色谱柱中仅有流动相通过检测器时，所检测到的信号。2.峰高从色谱峰顶点到基线之间的垂直距离。323.区域宽度1）半峰宽（Y1/2）：2）峰底宽（Wb）色谱峰高一半处的宽度色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距之间的距离。33气相色谱流出曲线344.保留值(retentionvalue)1）用时间表示的保留值保留时间(tR)：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间。不与固定相作用的气体的保留时间。调整保留时间(tR')：tR'=tR－tM死时间(deadtime,tM)：352）用体积表示的保留值组分从进样到柱后出现浓度极大值时所通过的流动相体积VR=tR×F0色谱柱内未被固定相占据的空隙体积调整保留体积(VR')：VR'=VR－VM死体积(VM)：VM=tM×F0保留体积(VR)：361212RRRR21VVttrsRKVVtR=tM(1+k)3）相对保留值r21又称选择因子，只与柱温和固定相性质有关表示了固定相对这两种组分的选择性6.保留值与分配比k的关系5.保留值与分配系数K的关系37色谱峰反映的信息：1）根据峰的个数，判断样品中所含最少的组分数2）根据保留值对色谱峰进行定性分析3）根据峰高或面积进行定量分析38§15-3色谱法基本理论1.塔板理论(platetheory)2.速率理论(ratetheory)39一、塔板理论塔板理论把色谱柱比作一个分馏塔，假设柱内有n个塔板，每个塔板高度称为理论塔板高度，用H表示，在每个塔板内，试样各组分在两相中分配并达到平衡，最后，挥发度大的组分和挥发度小的组分彼此分离，挥发度大的最先从塔顶（即柱后）逸出。尽管这个理论并不完全符合色谱柱的分离过程，色谱分离和一般的分馏塔分离有着重大的差别，但是因为这个比喻形象简明，因此几十年来一直沿用。40理论假设：1）色谱柱由一块一块的虚拟塔板组成，在一个塔板内组分在气液两相间可以很快达到平衡；2）塔板内一部分空间由固定相占据，另一部分由流动相占据，称为板体积；1941Martin415）分配系数在各塔板上是常数。3）载气进入色谱柱不是连续而是脉动的，每次进气为一个板体积；4）试样沿色谱柱方向的扩散可以忽略不计；42设色谱往由5块塔板（n＝5，n为色谱柱的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r＝0，1，2…，n－l；某组分的分配比k=1，根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量的，即m＝1的组分加到0号塔板上，分配平衡，即mS＝mM＝0.5。434445色谱流出曲线将离开色谱柱物质的量作纵坐标，载气塔板体积做横坐标得到色谱图46随着脉冲载气的加入，组分从色谱柱出口流出进入检测器。实际上，组分在柱内的分布就是二项式的展开式：P为组分分配在液相中的质量，q为组分分配在气相中的质量。当n＞100，流出曲线的形状就呈高斯分布，一般气相色谱柱的n约为103～106。47对于色谱过程而言，n很大，采用数学上近似处理方法，可推导色谱流出曲线上任意一点样品的浓度值：C－色谱流出曲线上任意一点样品的浓度；n－理论塔板数；m－溶质的质量；VR－溶质的保留体积；V－色谱流出曲线上任意一点的保留体积48决定色谱峰最大浓度的因素：进样量越大，峰高越大；相同保留时间，塔板数越大，峰高越大；固定进样量和塔板数，保留时间越小，色谱峰高且窄；反之，保留时间长的组分色谱峰低且宽。49由流出曲线方程可推出：而理论塔板高度（H）即：222/1)(16)(54.5WtWtnrrnLH502bR22/1R)(16)(54.5WtYtn有效有效有效nLH注意：同一色谱柱用不同物质计算可得到不同的塔板数。有效塔板数有效塔板高度51塔板理论的优点:塔板理论是一种半经验理论，它初步揭示了色谱分离过程。塔板理论在色谱中的意义在于：色谱流出曲线符合高斯峰分布；塔板数作为衡量柱效指标是有效的；浓度极大点的位置Cmax符合实验结果。522.用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。1.柱长一定，有效塔板数n越大，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能越高。3.柱效不能表示被分离组分的实际分离效果。53塔板理论假设的缺点：在气相色谱中，忽略分子纵向扩散；流动相的运动是跳跃式的、不连续的假设显然违背了实际色谱过程；实际色谱过程难于达到真正的平衡状态；分配系数与浓度无关只在一定的范围内成立。54塔板理论的最大缺点：说明不了色谱流出曲线峰展宽的本质及曲线形状变化的影响因素；说明不了各种实验操作条件变化所引起的色谱峰峰宽变化的原因；无法把各种色谱参数与塔板高度定量地关联起来，特别是不能解释流速对柱效率的影响。综上所述：塔板理论虽为半经验理论，但在色谱学发展中起到了率先作用和对实际工作的指导作用。552.速率理论前面已知，用塔板理论来说明色谱柱内各组分的分离过程并不合理，因为色谱柱内并没有塔板。当同一试样进入同一色谱柱，当流动相速度变化时，得到不同的色谱图。测得的n和H也不同，充分说明塔板理论不足以说明色谱柱的分离过程。561956年荷兰学者VanDeemter等人在研究气液色谱时提出色谱过程的动力学理论，它是在吸收了塔板理论中塔板高度概念的同时，考虑了影响塔板高度的动力学因素，指出理论塔板高度是峰展宽的量度，导出了塔板高度H与载气线速度u的关系式，即速率理论。